HPLC-DAD测定血浆拉莫三嗪、奥卡西平及10-羟基卡马西平浓度效果观察

楼江 林能明 刘占利 王飞 李晴宇 史长城 严伟

拉莫三嗪（lamotrigine，LTG）是苯三嗪类抗癫痫药物，主要通过阻断突触前膜电压敏感性钠离子通道，抑制谷氨酸和天冬氨酸的释放，发挥抗癫痫作用；奥卡西平（oxcarbazepine，OXC）是卡马西平的10-酮基衍生物，在体内可迅速转化成活性代谢物10-羟基卡马西平（10-monohydroxycarbazepine，MHD）发挥抗癫痫作用[1]。但上述两种药物药动学个体差异大，治疗窗窄（LTG治疗窗 3～14μg/ml，OXC 治疗窗为 3～35μg/ml），服用相同剂量，部分患者可能出现不良反应，因此有学者建议对服用LTG和OXC的患者进行血药浓度监测，并根据血药浓度调整LTG和OXC用量，以提高LTG和OXC的疗效并降低不良反应发生率[2-4]。目前，国内外已有研究报道人血浆中LTG、MHD和OXC的分析方法，液相色谱-串联质谱法（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）虽灵敏度高，但仪器成本和维护费用昂贵；而文献报道的高效液相色谱法（high performance liquid chromatography，HPLC）法，大多采用液-液萃取或液-固萃取前处理法，该法耗时较长，操作繁琐且费用较贵；相比于文献报道的紫外检测器检测，二极管阵列检测器（diode array detector，DAD）可对被测物质和内标进行全波长扫描，选取最优检测波长，同时可设定参比波长，消除噪音干扰，提高检测的灵敏度[5-7]。本研究在文献报道的基础上，以甲醇为蛋白沉淀剂，建立了同时测定人血浆中LTG、OXC和MDH浓度的HPLCDAD法，现将结果报道如下。

1 材料和方法

1.1 仪器 Agilent1260高效液相色谱仪：包括四元泵（型号∶G1311B）、自动进样器（型号∶G1329B）、柱温箱（型号∶G1316A）和 DAD 检测器（型号∶G1315D）购自美国Agilent公司；低速离心机（DM0412S）、涡旋混合器（MXS）购自美国赛洛捷克公司；低温高速离心机（5418R）购自德国艾本德股份公司；超纯水系统（Thermo fisher LabTower ED1）购自美国赛默飞世尔科技公司。

1.2 药品与试剂 LTG（美国Sigma公司，纯度≥98%，10mg）；OXC（中检所，纯度：99.8%，100mg）；MHD（南京康满林有限公司，纯度：97%，250mg），氯唑沙宗（中检所，纯度：99.7%，100mg），血浆：人体血浆，甲醇和乙腈（色谱级，德国默克公司），磷酸二氢钾（分析纯）。

1.3 方法

1.3.1 色谱条件 色谱柱Agilent Zorbax Eclipse Plus C18（4.6×100mm，3.6μm）；柱温：35℃；流动相：乙腈-10 mmol/L KH2PO4（V/V，24∶76，pH5.5）；流速：0.8ml/min；进样体积：10μl；检测波长220nm，参比波长360nm。

1.3.2 溶液的配制 LTG标准液配置：精密称取LTG 9.6mg，加甲醇溶解并定容至 10ml，得到 960μg/ml的LTG标准液。OXC标准液配置：精密称取OXC 11.0mg，加甲醇溶解并定容至10ml，得到1 100μg/ml的OXC标准液。MHD溶液配置：精密称取MHD 19.6mg，加甲醇溶解并定容至10ml，得到1 900μg/ml的MHD标准液。精密吸取 LTG 4.17ml、OXC 3.64ml和 MHD 2.11ml置于容量瓶中，用甲醇溶解并定容至10ml，得到LTG、OXC和MHD混合液，3种物质浓度均为400.0μg/ml。氯唑沙宗溶液配置：精密称取氯唑沙宗10.0mg，用甲醇溶解并定容至10ml，得到1000μg/ml的内标液；精密吸取500μl氯唑沙宗标准液，置于10ml容量瓶中，用甲醇定容，得到50μg/ml的内标储备液。以上储备液均置4℃冰箱保存备用。

1.3.3 血浆样品预处理 精密吸取200μl血浆置于1.5ml离心管中，加入内标50μl（浓度50μg/ml）及400μl甲醇溶液，涡旋混匀2min后，4℃低温下离心10min（14 000r/min），取300μl上清液于进样瓶，10μl进样分析。1.4 方法学验证 根据《中国药典2015版（第4部）》中《生物样品定量分析方法验证指导原则》对该方法的专属性、标准曲线、回收率、日内和日间精密度以及稳定性等进行考察[8]。

1.4.1 专属性 取6份健康体检者的空白血浆，按“1.3.3”项方法处理后进样，考察该方法的专属性。

1.4.2 标准曲线 取LTG、OXC和MHD混合稀释液400μg/ml，用甲醇逐级稀释得 10.0、20.0、50.0、100.0、200.0μg/ml的LTG、OXC和MHD混合液；再用空白血浆将 10.0、20.0、50.0、100.0、200.0 和 400.0μg/ml的LTG、OXC和MHD混合液稀释10倍，得到LTG、OXC和MHD的血浆标准曲线浓度分别为 1.0、2.0、5.0、10.0、20.0 和40.0μg/ml。按“1.3.3”项方法处理后进样，测得 LTG、OXC和MHD和内标的峰面积，以待测物峰面积和内标峰面积之比为纵坐标（y），各待测物浓度为横坐标（x），进行线性回归分析。

1.4.3 精密度和回收率实验 用空白血浆分别配置LTG、MHD和OXC的混合质控样品，低、中和高浓度分别为 2.0、10.0 和 30.0μg/ml，按“1.3.3”项方法处理后分析，每个浓度平行5份，计算日内精密度及方法回收率，该步骤连续测定3d，计算日间精密度及方法回收率。精密度采用相对偏准偏差（relative standard deviation，RSD）表示，RSD=标准偏差（SD）/测定结果的平均数×100%，RSD＜15%证明该方法精密度良好。方法回收率为测定结果的平均数与真实值之间的比值，85%＜方法回收率＜105%，证明回收率良好。

1.4.4 稳定性试验 配置低、中、高3种浓度的LTG、MHD和OXC混合质控血浆，按“1.3.3”项处理后分析，每个浓度平行5份，观察样品室温放置（2、4、8和12h）、自动进样器放置（2、4、8和 12h）和反复冻融（1、2 和 3次）稳定性。RSD＜15%表明被测药物在上述条件下稳定性良好。

1.5 统计学处理 采用SPSS 19.0统计软件，以待测物峰面积（LTG、OXC和MHD峰面积）和内标峰面积之比为纵坐标（y），各待测物浓度为横坐标（x），进行线性回归分析，当相关系数r≥0.999时，证明线性关系良好。

2 结果

2.1 专属性 在本试验条件下，被测物及内标物均分离良好（分离度 R≥1.5min），LTG、MHD、OXC 和内标物（internal standard，IS） 的保留时间分别为 4.3、5.2、9.8 和11.5min，空白血浆中的内源性物质不干扰测定结果，见图1。

图1 高效液相色谱图（a：空白血浆；b：LTG+MHD+OXC+IS；c：患者服用拉莫三嗪12h后的血浆样品+IS；d：患者服用奥卡西平12h后的血浆样品+IS；e：患者服用拉莫三嗪+奥卡西平12h后的血浆样品+IS）

2.2 标准曲线 LTG的线性回归方程为y=0.171x+0.036（r=0.99974），MHD的线性回归方程为y=0.091x+0.018（r=0.99969），OXC 的线性回归方程为：y=0.130x+0.036（r=0.99969），结果表明 LTG、MHD 和 OXC 在 1.0～40.0μg/ml范围内线性关系良好。

2.3 精密度和回收率 LTG、OXC和MHD的方法回收率在93.4%～100.95%，日内和日间精密度均＜6%，结果表明该方法下LTG、OXC和MHD的回收率和精密度较好，见表1。

表1 LTG、OXC和MHD的日内、日间精密度和回收率

2.4 稳定性试验 LTG、MHD和OXC在室温放置稳定性、自动进样器放置稳定性和冻融稳定性条件下的RSD均＜8%，结果表明该方法下LTG、MHD和OXC的稳定性较好，见表2。

表2 LTG、OXC和MHD在各种条件下的稳定性实验

3 讨论

3.1 检测波长的选择 本研究使用DAD对被测物质及内标的使用全紫外波长（190～400nm，步进值2nm）进行扫描，发现近紫外区210nm处的信号较强，但溶剂吸收干扰严重。经反复试验比较，取220nm不仅可排除溶剂吸收干扰，还可获得最佳灵敏度，故选220nm为本研究的检测波长。试验发现360nm波长处样品没有吸收，且最接近检测波长，为消除基线噪音干扰，选择360nm作为本研究的参比波长。

3.2 流动相的选择 本试验曾尝试使用甲醇-水和乙腈-水作流动相，但发现被测物质色谱峰拖尾严重，这可能与被测物质含伯氨、叔氨等有机氮结构有关，它们可与C18色谱柱内未参加键合反应硅醇基发生正、负电荷的吸附，引起拖尾。当以10mmol/L和50mmol/L KH2PO4作水相，发现缓冲盐溶液可显著影响被测物质的色谱行为（包括色谱峰和保留时间），因缓冲液浓度越高，对色谱柱的损害可能越大，不易维护保养，最终选择10 mmol/L KH2PO4缓冲液作该条件的水相。

3.3 内标的选择 已有研究报道LTG或OXC的测定，可用苯巴比妥和氯唑沙宗作内标[6，9]。本试验曾尝试使用另一苯二氮卓药物地西泮和氯唑沙宗作内标，发现地西泮与被测物的保留时间相差较大，不适用于分析测定，但氯唑沙宗在该条件下分离度好，保留时间较适合，最后选择氯唑沙宗作为本研究的内标物质。

3.4 前处理的选择 文献报道LTG、MHD和OXC的测定，常采用液-液萃取或固相萃取作为前处理，操作繁琐且费用昂贵[6-7]。因此本研究曾尝试使用甲醇、乙腈和高氯酸溶液作为蛋白沉淀剂，发现高氯酸和乙腈的回收率较低，尤其是低浓度样品，因此本研究最后选用甲醇作为蛋白沉淀剂。

综上所述，本研究针对LTG、MHD和OXC血药浓度个体差异大的特点，建立了快速、灵敏和高效的测定人血浆中LTG、MHD和OXC的HPLC-DAD法，适用于服用LTG和OXC患者的常规治疗药物监测。