SerPinA1在肾癌中的表达及意义

杨天时，于 新，王晶莹，谢 风，何成彦

(吉林大学中日联谊医院 检验科，吉林 长春130033)

肾癌主要是由肾小管上皮细胞起源的，又被称为肾细胞癌(RCC) ，主要在泌尿小管的各个不同位置分布。相关统计指出，目前肾癌在多种成人恶性肿瘤中所占比例约为2%-3%。在我国，肾癌的发病率位居于第三位，仅位于膀胱癌和前列腺癌之后，是泌尿系统中较为常见的肿瘤，可导致患者的死亡，近些年在全世界的发病率有明显上升的趋势[1]。人体内的serPin可分成九个亚家族，即：A-I，其中，最大的两个家族是类卵清蛋白家族和类α1-抗胰蛋白酶家族。人类最主要的蛋白酶抑制物，即丝氨酸蛋白酶抑制剂A1是一种蛋白质，有着高度的保守结构，其比例在血浆总蛋白酶的抑制能力中可达90%以上[2]。作为急性时性反应蛋白，丝氨酸蛋白酶抑制剂A1大部分是在肝细胞内合成的，在肠上皮细胞、单核巨噬细胞及肾实质等肝外组织及某些肿瘤细胞中也可以产生[3]。有研究显示，丝氨酸蛋白酶抑制剂在患有肝癌、肺癌、膀脱癌等恶性肿瘤的患者体内表达水平也会增高。但截止至目前，在肾癌中关于serPinA1的研究仍比较少，因此本实验采用液质联用技术及Western blotting两种方法，目的在于研究在肾癌及癌旁健康组织中serPinA1的表达情况及临床意义，为肾癌的发病机制、临床诊断及治疗提供有益线索。

1 材料与方法

1.1材料

选取吉林大学中日联谊医院肾内科及泌尿外科已经接受手术治疗的患者，从中选取肾癌组织标本36例，确保这些患者在进行手术前未应用任何方式治疗。在患者进行手术当中即时冲洗取材，取材后及时的用液氮速冻封存。本实验所用的肾癌组织标本均为病理学检查证实有效，癌旁正常组织均取自癌组织上缘。

1.2仪器及试剂

取自总部位于加州的伯乐生命医学产品有限公司(Bio-Rad公司)的蛋白质定量试剂盒。考马斯亮蓝-G250，默克密理博(Milli-QIntegral)超纯水发生装置于碧云天生物技术公司购得。LT_QXL线性离子肼质谱仪、UV-2000型分光光度计于赛默飞世尔公司购得。1200纳升级液相色谱分析仪于美国安捷伦科技公司购得。DNA酶及RNA酶于西格玛公司(美国)购得。PMSF、TPCK、DTT、TMED于美国GE公司购得。

1.3实验方法

1.3.1提取样本的总蛋白，检测其浓度将50 mg肾癌组织及癌旁健康组织在液氮冻存的环境中取出来，并将两种标本磨成粉末。研磨后向其中加入已经制备好的裂解缓冲液，目的是为了去除DNA和RNA。然后用离心机离心后吸取标本的上清液，即为总蛋白质。用微量蛋白质快速测定法，即布拉德福德(Brandford)法测定蛋白浓度，用考马斯亮蓝-G250染色，用分光光度计在595 nm处测定吸光度并绘制曲线(以蛋白质浓度为横坐标，A595 nm为纵坐标)，根据吸光度测定所得的蛋白浓度，在实验结束后置于-80℃的冰箱中保存。

1.3.2制备组织蛋白，水解多肽混合物 将样本于-80℃的冰箱中取出，放至室温后，将组织蛋白用碳酸氢铵稀释液稀释提取，目的是为了使尿素浓度低于2 mol/L。加入DTT充分混匀后，使其最终浓度为20 mmol/L，然后使反应物平衡至室温，室温时再加入IAM，充分混匀后，调定为50 mmol/L的终浓度，避光使其反应30 min。加入胰酶，使蛋白和胰酶按照50∶1的比例，将其置于37℃水浴箱孵育过夜，将酶切产物存于-80℃的冰箱中。

1.3.3液质联用技术分析分离鉴定多肽混合物用0.1%甲酸使上述样品溶解，每次取50 μg样品，为了进行洗脱分离，使样品首先通过串联的强阳离子柱，继而通过C18反相柱。用LT_QXL质谱仪以数据依赖的方式将得到的多肽进行串联质谱分析扫描。经上述操作可得到相应图谱(MS/MS)，在Bioworks 3.3.1 SP1上整合图谱，应用其中的蛋白分析软件(SEQUEST)来检索数据库，对蛋白及多肽进行鉴定及差异比较。

1.3.4免疫印迹试验将serPinA1作为目标蛋白，用Western blot进行试验，以进一步验证在肾癌组织中serPinA1的高表达。于安捷伦科技公司购买serPinA1单克隆抗体，β-Actin为内参抗体。

1.4统计学分析

应用SEQUEST的方法，利用SPSS13.0对将二维液相色谱与质谱联用所得数据进行t检验分析，用t检验分析对液质联用所得图谱进行分析，当P<0.05时，差异具有统计学意义，即有显著差异。

2 结果

2.1肾癌组织及癌旁健康组织蛋白酶解混合产物的液质联用分析肾癌组织及癌旁健康组织酶解后，应用液质联用分析，对所得到的多肽质谱数据进行采集、分析及整理，其中肿瘤组织酶解混合物共鉴定了3440个多肽序列，癌旁健康组织共鉴定了1321个多肽序列，肿瘤组织得出882个蛋白质鉴定资料，癌旁组织得到321个蛋白质鉴定资料。

2.2将质谱分析应用于肾癌组织与癌旁健康组织差异蛋白质本实验中，用谱图数在两组样品中同一个蛋白质的丰度进行评价。对于蛋白质丰度的变化，需要满足两个条件，即两个样品中蛋白谱图数的比值应≥1；两个样品中蛋白谱图数的差值要≥72。每种样品均行三次实验以避免误差，而后进行综合分析。实验中共得到41个差异蛋白，其中36个为上调蛋白，其余为下调表达。可见本实验中serPinA1蛋白是明显上调的，其质谱结果见图1。

图1 肾癌组织与癌旁健康组织差异蛋白质质谱结果

2.3SerPinA1蛋白免疫印迹结果应用Western blot法对serPinA1蛋白在肾癌组织与癌旁组织的表达情况进行验证。根据丝氨酸蛋白酶抑制剂A1的表达情况，将丝氨酸蛋白酶抑制剂A1在癌组织与癌旁组织中的表达进行比较，其明显高表达于癌组织。可见图2。这个使serPinA1蛋白在肾癌组织中是高表达，在癌旁组织中是低表达得到了进一步的证实。

A:癌旁组织;B:癌组织

3 讨论

肾癌起病隐匿，一般患者出现症状前来就诊时已处于中晚期，行手术、放化疗及透析治疗等治疗方式，不仅给患者带来了极大的痛苦，且预后较差，生存率较低。因此，寻找一种或几种敏感敏感指标以早期确诊肾癌至关重要。为了尽早的发现灵敏度高、特异度好的肿瘤标志物，可选择利用差异蛋白质组学进行分析的蛋白质组学技术，可以使肿瘤被早期诊断，进而早期治疗，也能改善患者的预后，这是具有非常重要的意义的，同时也能给患者和家属带来非常大的帮助，给他们带来希望。

有研究表明，在多种癌症中serPinA1蛋白均呈先高表达的状态，如：lung cancer、breast cancer、ovarian cancer、liver cancer、gastric cancer等[4]。国外学者研究表明，serPinA1在4级神经胶质瘤中明显高表达于3级神经胶质瘤，而且高表达的serPinA1标明预后差[5]。马瑛[6]等人的研究还表明丝氨酸蛋白酶抑制剂在卵巢癌的发展过程中可能仍发挥着肿瘤抑制基因的作用。丝氨酸蛋白酶抑制剂可能通过从蛋白质和mRNA水平下调的卵巢癌中VEGF的表达这一机制抑制卵巢癌血管生成。Shakya R[7]等人的研究表明，丝氨酸蛋白酶抑制剂的亚型alpha-1在肺癌的诊断中有着重要的价值。它可以协同TP53，大大增加了TP53的表达，对肺癌的诊治有着十分重要的意义。冯希伯-林道氏病(VHLD)是一种罕见的遗传性肿瘤综合征。在所有与VHLD相关的肿瘤中，透明细胞肾细胞癌(ccRCC)是导致死亡的主要原因。在Mandili G等

人的试验中，比较了VHLD患者、ccRCC患者和健康志愿者的尿蛋白组，结果表明在所有不同表达的蛋白质中，alpha-1抗胰蛋白酶(A1AT)在具有ccRCC历史的VHLD患者的尿液中是非常丰富的。故A1AT可能是一种非侵入性生物标记物，它在VHLD的诊治中有一定的辅助诊断意义[8]。

以上这些研究说明丝氨酸蛋白酶抑制剂A1参与了多种肿瘤的发生和发展。本实验采用液质联用及Western blotting分验证了serPinA1在肾癌组织及癌旁健康组织的表达情况：即表达的蛋白量在肾癌组织中明显高于癌旁健康组织。因此，检测丝氨酸蛋白酶抑制剂A1在肾癌组织中的表达水平可以作为一种早期筛查癌变的辅助标志物，为肾癌的早期诊断及治疗提供了新的方向。但是仍需进一步完善serPinA1在肿瘤进展中的机制，以便更好的为临床服务。