不同剂量液体复苏对脓毒性休克大鼠炎症因子调控及安全性评价

田加坤，陈星海，张 敏，李杏良，纪富溪，刘德新*

(1.吉林大学第二医院 急救医学科,吉林 长春130041；2.河南省医院 急诊科)

脓毒性休克是目前危重症医学领域高发病率和高病死率的疾病，在美国和欧洲，发病率每年以1.5%的速度递增，原因与免疫系统功能缺陷病人数目的增加、耐药菌的感染、高风险的手术干预等因素有关，并且病死率随着年龄和衰竭器官数目的增加而增加[1-6]。液体复苏是脓毒性休克救治中重要手段之一，《2012严重脓毒症及脓毒性休克管理指南》进一步强化集束化治疗策略，强调早期液体复苏，规定了复苏目标值，指出对脓毒症所致组织灌注不足的患者可采取液体冲击疗法，至少按30 ml/kg输注晶体液，直至患者血流动力学获得改善[7]。但由于临床常用的液体复苏剂量个体差异较大，且部分患者合并心肺功能不全，多大剂量液体复苏更安全有效，以及液体复苏对脓毒性休克发病机制方面的影响仍不明确。本研究通过脓毒性休克大鼠模型进行不同剂量液体冲击复苏，探讨不同剂量液体复苏对脓毒性休克大鼠的炎症因子影响及对液体复苏安全性进行评价，为寻找脓毒性休克时最佳液体复苏剂量提供实验依据。

1 资料与方法

1.1 实验动物及主要试剂

清洁级 S-D 大鼠36只，年龄 6-8周左右，体重为 193.4±11.7 g，购自吉林大学实验动物中心。复方氯化钠注射液(四平市巨能药业有限公司)；大鼠TNF-α、IL-6、IL-10定量ELISA试剂盒购自美国RD公司；BL-420S 生物机能实验系统购自成都泰盟科技有限公司。

1.2 实验动物模型制备及液体复苏方法

脓毒性休克大鼠模型制备:麻醉后大鼠取仰卧位，碘伏消毒中下腹部皮肤备皮后，提起腹部皮肤，用眼科剪于腹白线中点下方约 0.3 cm 处逐层剪开皮肤、肌层和腹膜约 1.5 cm的长度，另只手用平镊固定肌层，探开腹腔后在直视下，寻找盲肠末端后逐步游离并置于腹腔外；用 4 号缝合线结扎距盲肠末端约 1.5 cm 处，结扎后用直径1.5 mm大针穿刺针垂直盲肠穿刺 2 孔；针尾带入20 mm×2.5 mm腹腔引流条2条，贯穿肠管，还纳盲肠，4 号线逐层缝合关腹。颈动脉置管连接BL-420S 生物机能实验系统监测大鼠血压，大鼠血压下降为基础值的30%定义为脓毒症休克模型制备完成。股静脉置管为补液做准备。

液体复苏：将出现血压下降达到休克的大鼠36只，随机分为30 ml/kg、45 ml/kg、60 ml/kg液体复苏组，每组12只，分别按30 ml/kg、45 ml/kg、60 ml/kg剂量给予液体冲击补液，待血压稳定后，减慢输液速度，若再次出现血压下降可重复进行不同剂量液体冲击直至血压稳定，密切观察大鼠一般情况及行为学变化等特征情况。

1.3 观察指标

三组大鼠均在液体复苏开始、液体复苏后3小时及液体复苏后6小时抽血，用ELISA方法测定血清TNF-α，IL-6和 IL-10水平；液体复苏6小时后处死动物观察三组大鼠肺、肝、肾、心脏组织结构的病理改变。

1.4 统计学处理

2 结果

2.1 液体复苏后脓毒性休克大鼠一般情况及行为变化

对脓毒性休克大鼠进行不同剂量液体复苏，平均2.5-4 h时出现大量尿液。液体复苏开始时大鼠仍较为活跃，后期逐渐出现竖毛，毛色晦暗，身体捲缩，略发抖，触之易受惊，活动饮水进食少，偶出现腹泻，反应迟缓，眼角分泌物增多。

2.2 不同剂量液体复苏对大鼠血清炎性细胞因子水平的影响

本研究对脓毒性休克大鼠分别给予30 ml/kg、45 ml/kg、60 ml/kg液体复苏，记录3组大鼠液体复苏开始、复苏3 h、复苏6 h血清中促炎因子TNF-α、IL-6水平及抗炎因子IL-10水平。发现经过液体复苏3 h、6 h后，脓毒性休克大鼠的促炎因子TNF-α、IL-6水平较液体复苏开始时下降，抗炎因子IL-10水平升高，P<0.05。但比较30 ml/kg、45 ml/kg、60 ml/kg液体复苏3组之间大鼠血清TNF-α、IL-6及IL-10水平，差异无显著性，P>0.05。提示液体复苏能降低脓毒性休克时机体促炎因子水平，同时升高抗炎因子水平，调节炎症反应失衡。30 ml/kg、45 ml/kg液体复苏即能抑制全身炎症反应，继续加大液体复苏剂量并未进一步改善全身炎症反应状态,结果见表1-3。

表1 不同剂量液体复苏后大鼠血清TNF-α水平比较

注：※与液体复苏开始时比较，P<0.05；△各组间比较，P>0.05。

表2 不同剂量液体复苏后大鼠血清IL-6水平比较

注：※与液体复苏开始时比较，P<0.05；△各组间比较，P>0.05。

表3 不同剂量液体复苏后大鼠血清IL-10水平比较

注：※与液体复苏开始时比较，P<0.05；△各组间比较，P>0.05。

2.3 不同剂量液体复苏后脓毒性休克大鼠的病理变化

液体复苏6 h后处死大鼠，大体解剖见结扎处盲肠肿胀严重，周围肠管有化脓现象，且与周围胰、小肠、胃等组织粘连，有血性腹水及恶臭。其余脏器组织略显苍白，脏器表面有散在出血点，肝脏淤血增大。不同剂量液体复苏组大鼠的肺、肝、肾、心脏大体病理改变无显著差别。

光镜观察三组大鼠液体复苏6 h后，肺组织出现血小板聚集和纤维蛋白沉积在肺毛细血管，局部可见血管淤血，白细胞浸润；肺泡蛋白沉积，呈现出富含蛋白质的肺泡水肿，纤维蛋白沉积为透明膜覆盖肺泡上皮，间质纤维化、肺充血和肺萎陷混合存在。3组间比较无明显差异，见图1。

图1 不同剂量液体复苏6 h后大鼠肺组织HE染色(400×)

液体复苏6 h后，3组大鼠肝脏组织可见小叶中心肝窦扩张充血，偶见周围的单个肝细胞坏死，小叶中心肝细胞坏死或中间地带枯否氏细胞肿胀，坏死，血栓形成和微肝细胞空泡化，值得注意的是， 60 ml/kg液体复苏组大鼠肝周可见细胞肿胀，较30 ml/kg、45 ml/kg液体复苏组明显，见图2。

图2 不同剂量液体复苏6 h后大鼠肝脏组织HE染色(400×)

液体复苏6 h后，3组大鼠肾脏可见炎症细胞浸润，肾小球肿胀，肾小管上皮细胞肿胀，管型。偶见肾小球毛细血管内存在微血栓形成，肾小管坏死，管腔扩张、肾小管空泡膨胀的嗜碱性粒细胞的变化。3组之间病理改变未见明显差异。见图3。

图3 不同剂量液体复苏6 h后大鼠肾脏组织HE染色(400×)

液体复苏6 h后，脓毒性休克大鼠心肌组织可见非特异性的组织学变化，偶见间质水肿，心肌微血管内纤维蛋白沉积、心肌肌纤维排列紊乱。少见心肌坏死、血栓，心内膜和心外膜出血的局限性出血。比较3组大鼠病理改变未见明显差异。见图4。

图4 不同剂量液体复苏6 h后大鼠心脏组织HE染色(400×)

3 讨论

脓毒性休克引起多器官功能障碍的重要发病机制是感染、毒素、以及血流动力学紊乱诱导大量炎症因子的释放，凝血功能障碍、进而造成重要脏器损害，其中促炎及抗炎反应失衡是脓毒性休克病理生理过程中的关键因素[8,9]。IL-6，TNF-α是重要的促炎因子，可以通过促进炎症细胞的聚集、活化及炎症因子的分泌等方式在脓毒性休克的发生、发展中发挥重要的作用，炎症因子表达的水平与脓毒性休克的严重程度及预后密切相关[10-14]。

充分的液体复苏是治疗脓毒性休克的至关重要的措施之一，目前指南推荐的是基于Rivers等于 2001 年提出的“早期目标导向治疗” (early goal-directed therapy，EGDT)，强调在动态定量指标的指导下进行滴定式治疗。他们研究发现脓毒性休克最初6 h经过积极早期目标导向治疗后，患者的28天病死率下降16%[15]。近期也有对EGDT不改变预后提出质疑的声音，特别是临床实践中多大剂量液体能更快速、更安全有效地用于脓毒性休克复苏并不明确,甚至存在争议[16-18]。

本研究发现进行液体冲击治疗后大鼠促炎因子表达水平显著降低，抗炎因子水平则显著升高，提示30 ml/kg、45 ml/kg、60 ml/kg液体复苏都可以抑制脓毒性休克炎症反应的进展，进而可能改善预后。但比较不同剂量液体复苏组炎症因子水平，结果显示组间无显著性差异，表明30 ml/kg-60 ml/kg液体复苏对稳定脓毒性休克是有益的，但继续增加补液量并未对炎症因子产生明显的影响，单纯采取液体复苏的手段对脓毒性休克时促炎抗炎反应失衡的调控是有限的，仍需要去除根本病因并采取集束化治疗。

本研究中使用不同剂量液体苏6 h后，观察各组大鼠肺、肝、肾、心脏的病理改变，并未出现所估计严重水肿的出现，组间比较病理改变无显著性差异。但值得注意的是，在60 ml/kg液体复苏组发现肝周细胞肿胀，较30 ml/kg、45 ml/kg液体复苏组明显。在临床实践中，由于积极的液体复苏常导致液体过负荷，加上毛细血管渗漏等因素，容易加重心、肺、肝、肾等重要脏器损伤,使脓毒性休克的病死率升高。Vicent JL等研究发现，24个国家198个ICU中1177例脓毒症和1970例非脓毒症患者相比，每日液体正平衡分别为1.8 L和0.5 L，每日液体正平衡量增加1 L，死亡的危险性便增加10%，而且经过多因素相关性分析证实液体超负荷是导致脓毒症患者死亡的独立危险因素[19]。近年来随着无创和微创血流动力学监测更多的应用于脓毒症患者的评估证实，避免液体过负荷有利于改善脓毒症的预后，本研究证实，对于大鼠脓毒性休克模型，30-45 ml/kg的早期液体冲击复苏相对安全，继续加大液体剂量可能有液体过负荷及加重毛细血管渗漏以及组织器官肿胀的风险。