加味不忘散对AD模型大鼠学习记忆及在体海马长时程增强的影响

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阿尔茨海默病(Alzheimer disease，AD)是一种隐匿起病、呈进行性加重的神经系统退行性疾病，临床上显著特征是学习记忆能力衰退[1]。有研究表明，记忆的形成与神经元突触可塑性密不可分，学习记忆能力的衰退与神经突触可塑性降低相关[2]，因而可通过神经元突触可塑性评价学习记忆能力。长时程增强(long-term potentiation，LTP)是神经元突触可塑性的直接表现形式[3-4]，因而通过观察突触LTP，可从神经电生理水平研究记忆形成及衰退过程[5]。前期研究表明，腹腔注射D-半乳糖联合鹅膏蕈氨酸(IBO)定向损毁双侧Meynert核可致大鼠学习记忆能力受损，在致衰基础上，破坏基底前脑-海马胆碱能神经元投射通路，抑制大鼠海马LTP，进而影响学习记忆功能。

不忘散是我国中医益智古方，出自唐代孙思邈《备急千金药方》，由远志、人参、茯苓、茯神、菖蒲5味中药组成。在古方不忘散基础上，结合多年临床经验，增加熟地黄、黄连、白术、当归4味中药，形成“加味不忘散”中药复方，在临床上用于防治AD取得较好的疗效。本研究观察加味不忘散对AD模型大鼠学习记忆及在体海马LTP的影响，以此探讨加味不忘散对AD的治疗作用及其神经电生理机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物 清洁型雄性Wistar大鼠40只，体重200 g±20 g，由北京市海淀兴旺动物养殖公司提供。

1.1.2 主要试剂及仪器 IBO购买于Sigma公司，生理盐水稀释，浓度为2 μg/μL；D-半乳糖购于武汉博士德生物有限公司。加味不忘散免煎剂(北京同仁堂)，组方：远志20 g，人参15 g，熟地黄15 g，茯苓10 g，茯神10 g，白术10 g，当归10 g，石菖蒲5 g，黄连5 g，免煎剂为颗粒状每剂含22 g。加味不忘散用生理盐水溶解，低剂量组浓度为0.9 g/mL，高剂量组浓度为1.8 g/mL。Morris水迷宫图像采集分析系统购自荷兰诺达思科技信息公司。

1.2 实验方法

1.2.1 模型的制备及给药 将大鼠随机分成空白对照组、AD模型组、加味不忘散低剂量组、加味不忘散高剂量组，每组10只，最终造模成功进入实验各组大鼠分别为9只、8只、7只、7只。AD模型组、加味不忘散低剂量组、高剂量组均按0.5 mL/100 g腹腔注射D-半乳糖溶液，空白对照组注射等量的生理盐水，每日1次，持续6周。第43日，AD模型组、加味不忘散低剂量组、高剂量组在水合氯醛麻醉下，给予双侧Meynert核损毁术：颅顶正中切口暴露颅骨，脑立体定位仪准确定位(前囟后1.4 mm，旁开2.3 mm，深7.0 mm)，使用微量注射器双侧定向注射IBO 1 μL，空白对照组注射等量生理盐水。从实验第1日起，加味不忘散低剂量组、高剂量组分别以0.9 g/mL和1.8 g/mL浓度加味不忘散灌胃，空白对照组和模型组以生理盐水灌胃，剂量为1 mL/100 g，每日1次，持续8周。

1.2.2 Morris水迷宫实验 治疗结束后，进行Morris水迷宫实验。水迷宫为直径150 cm的圆形水池，4个入水点位于均分的四个象限贴壁正中位置。第一象限正中离池壁30 cm处放置直径15 cm的圆形平台，平台低于水面2 cm，水温22 ℃±1 ℃，实验室保持安静，水池四周亮度均等。定位航行试验：实验持续5 d，每日分别从4个象限将大鼠面向池壁放入水中，记录大鼠找到平台的时间(逃避潜伏期)。若大鼠在120 s内发现平台，记录时间并使其停留10 s；若120 s内未能发现平台，停止实验并将其放到平台停留10 s，记录其逃避潜伏期为120 s。空间探索试验：实验第6天，移除平台，使大鼠凭记忆寻找平台。每次大鼠在水迷宫中停留120 s，共2次，记录大鼠在120 s内的跨台次数。数据采集及处理由Morris水迷宫图像采集分析系统完成。

1.2.3 神经电生理实验 水迷宫实验结束后，25%乌拉坦腹腔注射麻醉大鼠，并固定于脑立体定位仪上，颅顶正中切口暴露颅骨，以前囟为0点，刺激电极坐标前囟后4.2 mm、旁开3.8 mm，记录电极坐标前囟后3.4 mm、旁开2.5 mm，颅骨钻打孔，将同心圆刺激电极及记录电极绑定并插入大鼠海马Schaffer侧支和CA1区放射层。首先进行测试，测试电流波宽为0.2 ms，以电流强度为横轴，以兴奋性突触后电位(excitatory postsynaptic potential，EPSP)为纵轴，描绘输入输出曲线，以引起最大幅度EPSP50%的刺激电流为基础刺激电流，在刺激电流不变前提下，不断调整绑定电极深度(即调整脑立体定位仪Z轴)，观察EPSP幅度0.4 mV～0.6 mV，固定电极Z轴位置并记录EPSP波形30 min以上，以此数据为基础EPSP。诱发LTP的高频刺激(high frequency stimulation，HFS)频率为200 Hz，电流强度同测试刺激，波宽为0.2 ms，共3串刺激脉冲，每串200个，串间隔为30 s。给予HFS后，引起LTP，连续记录1 h，利用多导生理信号采集系统记录并分析。

2 结 果

2.1 Morris水迷宫实验结果 前5天定位航行实验，各组大鼠逃避潜伏期均逐渐缩短，表明大鼠有一定的空间学习记忆能力。AD模型组较空白对照组逃避潜伏期显著延长(P<0.001)，且在第6天跨台次数显著减少(P<0.001)，说明AD模型组空间学习记忆能力明显受损，提示AD造模成功。加味不忘散低剂量组、高剂量组较AD模型组逃避潜伏期缩短(P<0.001)，跨台次数增加(P<0.01或P<0.001)，说明加味不忘散对AD模型大鼠空间学习记忆能力有显著改善。加味不忘散高剂量组较低剂量组逃避潜伏期缩短(P<0.001)，跨台次数增加(P<0.001)，说明加味不忘散对AD模型大鼠学习记忆能力的改善作用具有剂量依赖性。详见表1。

表1 4组大鼠逃避潜伏期变化及跨台次数比较(±s)

2.2 神经电生理实验结果 观察指标为HFS后fEPSP与刺激前fEPSP的百分比，即fEPSP的增幅。HFS后1 min，4组大鼠fEPSP增幅均超过150%，表明LTP诱导成功。4组fEPSP增幅随着时间增加而衰减，空白对照组HFS后1 min、fEPSP增幅，较AD模型组差异有统计学意义(P<0.001)，说明AD模型组大鼠LTP受到显著抑制。加味不忘散低剂量组、加味不忘散高剂量组HFS后1 min、30 min、60 min fEPSP增幅较AD模型组显著增加(P<0.001)，加味不忘散高剂量组较加味不忘散低剂量组HFS后1 min、30 min、60 min fEPSP增幅显著增加(P<0.01)，说明加味不忘散对学习记忆的改善作用具有剂量依赖性。详见表2。

表2 HFS刺激后fEPSP增幅(±s) %

3 讨 论

AD是临床上常见导致痴呆的神经系统退行性疾病，该病发病机制复杂[6]。在动物实验中，建立一种可全面模拟发病机制的AD模型是实验成功的前提条件。有研究表明，在神经电生理水平，长期注射D-半乳糖可破坏海马突触超微结构，进而导致大鼠海马LTP诱导率和诱导波幅均显著下降[7]。大鼠基底前脑发出的纤维广泛投射到海马及大脑皮层，这一通路与学习、记忆能力密切相关。胆碱能神经元突触传递是胆碱能神经元和脑内其他神经元之间的重要交流方式，AD病人脑内乙酰胆碱(acetylcholine，ACh)含量明显下降，基底前脑胆碱能神经元(basal forebrain cholinergic neurons，BFCNs)大量丢失，引起其胆碱能神经元突触传递严重受损[8]。有研究表明，在基底前脑注射IBO，破坏基底前脑-海马胆碱能神经元投射通路，进而影响学习记忆功能，这一方法广泛应用于AD造模[9-10]。有学者提出，联合上述两种方法建立AD模型思路，该模型简单、经济，且能全面模拟AD发病特征，已被广泛利用[11]。本研究结果显示，相较于空白对照组，D-半乳糖腹腔注射联合IBO损毁Meynert核的AD模型大鼠，学习记忆能力显著下降，LTP显著抑制，进一步证实该模型的有效性和可行性。

大量证据表明，AD病人早期出现海马突触功能改变，LTP作为突触可塑性的重要表现形式，可直观了解突触功能的改变[3，5]。本课题组前期研究表明，学习记忆能力受损的大鼠LTP受到显著抑制，远志等中药可显著减轻这种抑制作用[12-13]。本研究结果发现，AD模型组大鼠学习记忆能力显著下降，LTP受到明显压抑。通过加味不忘散治疗后，可提高AD大鼠的学习记忆能力，可能与改善LTP的抑制，进而提高海马突触可塑性有关。

本研究结果显示，加味不忘散组较AD模型组大鼠学习记忆能力显著增强，同时大鼠海马LTP抑制显著减轻，表明加味不忘散显著提高大鼠海马的突触功能，改善大鼠学习记忆能力，且该作用有剂量依赖性。本研究结果为加味不忘散在临床的应用提供理论基础，促进中医中药防治AD。