补肾活血方对动脉粥样硬化新西兰兔miRNA-217/Sirt1/FoxO1信号通路的影响

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目前老龄化是严重的社会问题之一，也是引起心脑血管疾病极其重要的危险因素。血管内皮细胞是处于血液与血管平滑肌之间的半通透性屏障，同时也是一个活跃的内分泌器官，在维持血管的完整性、调节血管稳态等方面起重要作用。内皮细胞衰老是血管整体老化的重要病理改变之一，引起血管功能紊乱，继而促进多种心脑血管疾病的发生发展，如动脉粥样硬化、心肌梗死、高血压、脑卒中等[1]。血管内皮细胞衰老在动脉粥样硬化发病中起着重要作用，MicroRNA-217(miRNA-217)参与调控内皮细胞衰老的进程[2-3]。前期研究证实，与模型组比较，阿托伐他汀钙组和补肾活血方组主动脉粥样硬化程度减轻，血管内皮端粒酶活性表达明显降低(P<0.01)[4]。本实验采用兔动脉粥样硬化模型，观察补肾活血方对miRNA-217相关信号通路的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物 2月龄雄性新西兰大耳兔44只，体重2.0 kg～3.0 kg，购自上海斯莱克实验动物中心[许可证号：SCXK(沪)2012-0002]。

1.2 实验药物 补肾活血方(组方：熟地黄10 g，枸杞子10 g，制黄精10 g，丹参10 g，川芎6 g，三七粉3 g，瓜蒌20 g，生山楂10 g)，由上海市中医医院制剂室制备。阿托伐他汀钙(美国辉瑞制药有限公司生产，生产批号：D1420203390，规格：每片20 mg)。

1.3 分组、造模及处理 将44只新西兰大耳兔随机分为对照组、模型组、补肾活血方组和阿托伐他汀钙组，各11只，其中对照组给予普通饲料，模型组、补肾活血方组和阿托伐他汀钙组给予高脂饲料(5%猪油、1%胆固醇、94%基础饲料)。造模8周后，各组随机处死1只，肉眼观察模型组、补肾活血方组、阿托代他汀钙组主动脉内膜，发现均有动脉粥样硬化斑块形成，确认造模成功，其他各组10只继续进行实验。对照组继续给予普通饲料喂养，模型组、补肾活血方组、阿托代他汀钙组给予高脂饲料喂养；对照组、模型组每日给予等量生理盐水(10 mL/kg)灌胃1次，补肾活血方组、阿托伐他汀钙组给予相应药物(10 mL/kg)灌胃1次，共灌胃8周。

1.4 实验试剂 Trizol：Invitrogen life technologies；上下游引物合成：上海皓嘉科技发展有限公司；DNA marker、SYBR(R) Prime Script RT-PCR Kit：TaKaRa；琼脂糖：上海生工生物工程有限公司。苯甲基磺酰氟(PMSF)：Amresco；细胞裂解液，十二烷基硫酸-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝胶试剂盒、SDS-PAGE电泳液、转膜液、封闭液、洗涤液、一抗稀释液、二抗稀释液：碧云天；辣根过氧化物酶HRP-ECL发光检测试剂盒：PIRECE；一抗：cell signaling technology；二抗：santa。

1.5 标本取材 麻醉后腹主动脉取血8 mL，开胸，取胸主动脉，剥离血管外结缔组织，4 ℃生理盐水中冲洗3次，部分加入10%甲醛溶液固定，部分放入-80 ℃冰箱保存待用。

1.6 观察指标

1.6.1 实时荧光定量PCR检测miRNA-217基因表达水平 Trizol法提取总RNA，紫外吸收法测定A260/A280比值，变性琼脂糖凝胶电泳法证实所提取RNA的完整性。反转录后，先绘制标准曲线，之后将所有样品分别进行目的基因和管家基因的实时荧光定量反应，最后采用相对定量——△△Ct法计算：

F=2-[待测组目的基因平均Ct值-待测组看家基因平均Ct值]-[对照组目的基因平均Ct值-对照组看家基因平均Ct值]

引物序列如下：内参β-actin：上游：5′-GGAGATTACTGCCCTGGCTCCTA-3′，下游：5′-GACTCATCGTACTCCTGCTTGCTG-3′；miRNA-217：5′-TACTGCATCAGGAACTGACTGGA-3′，反应条件：β-actin：95 ℃ 15 s，30个循环(95 ℃ 5 s，62 ℃ 20 s)扩增，62 ℃～95 ℃绘制溶解度曲线；miRNA-217：95 ℃ 15 s，30个循环(95 ℃ 10 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 25 s)扩增，62 ℃～95 ℃绘制溶解度曲线。

1.6.2 免疫印迹实验(western blot) 检测沉默信号调节器1(silent information regulator 1，Sirt1)/叉头转录因子(FoxO1)蛋白表达，取少量心肌组织在液氮中研磨，之后放入裂解液，粗提蛋白，BCA法测定蛋白量。之后取40 μg蛋白入10% SDS-PAGE凝胶电泳中，分离蛋白质，转印至硝酸纤维素膜，封闭后加入Sirt1、FoxO1一抗及二抗稀释液孵育，显色，应用图像数据采集系统拍照，测定各条带的吸光度值，最后分析各组蛋白相对含量。

1.7 统计学处理 采用SPSS 18.0软件进行数据分析，组间比较采用ANOVA(one or two way)或t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 实验完成情况 因本实验相对比较成熟，实验过程中无兔子自然死亡。

2.2 4组miRNA-217基因表达水平比较 与对照组比较，模型组miRNA-217表达升高，差异有统计学意义(P<0.01)；阿托伐他汀钙组和补肾活血方组与模型组比较，miRNA-217表达降低(P<0.01)；补肾活血组与阿托伐他汀钙组比较，miRNA-217表达降低(P<0.05)。详见表1。

表1 4组miRNA-217基因表达水平比较(±s)

2.3 4组Sirt1、FoxO1蛋白表达水平比较 模型组Sirt1、FoxO1蛋白水平明显低于对照组，差异有统计学意义(P<0.01)；阿托伐他汀钙组和补肾活血方组Sirt1、FoxO1蛋白水平高于模型组，差异有统计学意义(P<0.01)；与阿托伐他汀钙组比较，补肾活血组Sirt1蛋白水平高于阿托伐他汀钙组(P<0.05)。详见表2。

表2 4组Sirt1、FoxO1蛋白表达水平比较(±s)

3 讨 论

MicroRNA(miRNA)是一类由内源基因编码，长度约22个核苷酸序列的非编码单链RNA 分子，参与转录后基因调控，并广泛参与生物生长、发育、衰老、死亡等过程。其中miRNA-217在人脐静脉内皮细胞、主动脉内皮细胞、冠状动脉等均有表达，可参与调控内皮细胞衰老的进程[5-6]。通过抑制Sirt1的表达，使下游FoxO1和内皮型一氧化氮合酶(eNOS)乙酰化；其中乙酰化FoxO1可促进细胞凋亡，乙酰化eNOS活性降低，一氧化氮生成减少，氧自由基积聚，从而促进内皮细胞老化[7-8]。

国外研究发现，Sirt蛋白家族在代谢性疾病及衰老相关疾病的发生发展过程中发挥重要作用[9]。目前，Sirt家族基因研究较多的是Sirt1。Sirt1是哺乳动物Sirtuin家族的一员，是酵母Sirt2最相近的同源物，是一种烟酰胺腺嘌呤二核酸依赖性的组蛋白去乙酰化酶，参与多种生物学过程，可调节细胞增殖、凋亡、DNA损伤修复、衰老和代谢[9]，并参与多种生物体在能量限制应答中的寿命延长[9-11]。Sirt1通过抑制内皮细胞凋亡和改善血管内皮舒张功能及抑制平滑肌肥大增生影响动脉粥样硬化的发生、发展[12-13]。内皮Sirt1是体内一种真正的抗动脉粥样硬化因子。转染腺病毒Sirt1的内皮细胞能抵抗氧化低密度脂蛋白诱导的细胞凋亡。内皮特异过表达Sirt1促进高胆固醇状况的血管内皮依赖性血管舒张功能，高脂饮食及动脉粥样硬化危险因素降低主动脉Sirt1表达水平[14-15]。

中医学虽无“动脉粥样硬化”的病名，但可归于“胸痹”“心痛”“真心痛”“眩晕”“中风”等范畴。肾为生命之根，先天之本。此类病人多为中老年人，肾气渐亏，肾虚气化无力，不能推动血行，瘀血即成，不能推动水湿运行，痰浊即成。动脉粥样硬化病机以肾精虚衰为本，痰瘀内阻为标，治疗上自拟补肾活血方，方中熟地黄、枸杞子、制黄精滋肾阴；川芎、丹参、三七粉活血通络，使上药补而不滞；瓜蒌祛痰，生山楂活血化瘀，固护脾胃，以防养阴药滋腻滞气，全方共奏补肾活血祛痰之功。

本研究通过高脂喂养新西兰兔形成动脉粥样硬化模型，前期研究发现：随着动脉粥样硬化进程，内皮细胞提前衰老[4]。本研究结果显示：随着内皮细胞提前衰老，miRNA-217基因表达升高，同时其下游Sirt1、FoxO1蛋白表达降低。补肾活血方和阿托伐他汀钙皆可通过下调miRNA-217，上调Sirt1、FoxO1表达，延缓内皮细胞衰老，从而延缓动脉粥样硬化的发生。提示补肾活血方和阿托伐他汀钙抗动脉粥样硬化可能通过调控miRNA-217/Sirt1/FoxO1信号通路延缓内皮细胞衰老从而起到抗动脉粥样硬化作用。