黄芪甲苷对肥胖糖尿病大鼠肾脏氧化应激、Nrf2蛋白表达和胰岛β细胞的影响

刘文，章尹岗，别志霞，解为慈，叶迎春

糖尿病(DM)是以高血糖为主要特征的代谢紊乱综合征，糖尿病肾病(DN)是其常见慢性并发症，发病机制复杂，涉及高血糖、氧化应激等多种因素，其中氧化应激是关键因素之一，其产生的过量活性氧(ROS)可激活细胞内多种信号通路，介导高糖对肾组织的损伤[1-2]。有研究指出[3]，核因子E2相关因子2(Nrf 2)-抗氧化反应元件(ARE)信号通路是细胞抗氧化反应的中枢调节者。黄芪甲苷(AS-IV)是从传统中药黄芪中提取分离主要活性成分皂苷的有效单体成分，在临床试验研究中证实其具有抗炎、抗纤维化、抗糖尿病、抗氧化应激、心脏保护等多种药理作用[4]。有研究报道[5]，AS-IV可降低DM大鼠血糖水平，发挥抗氧化作用，减轻心肌损伤。但关于AS-IV对Nrf2-ARE信号通路的影响鲜有报道。本研究建立肥胖DM大鼠模型，观察AS-IV对大鼠肾脏氧化应激损伤的保护作用及对肾脏Nrf2-ARE信号通路的影响，旨在进一步了解AS-IV对DM大鼠肾脏损伤的防止作用及其机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料 (1)实验动物：健康雄性Wistar大鼠25只，购于重庆腾鑫华阜公司，周龄6～8周，实验前为标准饲养，日常光照，自然饮水。(2)主要试剂 ： STZ(链脲佐菌素，美国Sigma公司)，丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒(美国Omega公司)，总蛋白、核蛋白提取试剂盒(南京凯基生物科技公司)，兔抗Nrf 2多克隆抗体(美国Santa Cruz公司)，兔抗GAPDH单克隆抗体(美国CST公司)。(3)仪器设备：血糖分析仪(德国罗氏公司)、BH-2型光学显微镜(日本Olympus公司)、UVP分析仪(美国 BioSpec公司)。

1.2 模型建立与分组 2018年1—6月于武汉大学人民医院动物实验室进行实验，适应性喂养1周后，随机数字表法选取8只作为对照组，普通饲料喂养(碳水化合物65%，蛋白质25%，脂肪10%)；另外17只高脂饲料喂养(脂肪60%、碳水化合物20%、蛋白质20%)，喂养2周后，给予STZ 60 mg/kg一次性单剂量腹腔注射，建立DM大鼠模型，注射72 h后鼠尾静脉取血测血糖，将非禁食血糖>16.7 mmol/L，且能维持1周作为评价造模成功的标准，仅1只大鼠造模失败，16只大鼠造模成功。再按随机数字表法分为DM组及AS-IV组，各8只。AS-IV组给予80 mg·kg-1·d-1AS-IV灌胃给药，对照组和DM组给予等量0.5%羧甲基纤维素钠灌胃。连续给药8周。

1.3 观测指标与方法

1.3.1 标本收集： 给药8周后处死大鼠，处死前将大鼠放入代谢笼，留取24 h尿液并记录尿量，而后给予5%水合氯醛3 ml/kg腹腔注射麻醉后，腹主动脉取血，4℃ 3 000 r/min离心10 min，取上清低温-80℃冰箱保存；并于麻醉后剖腹取其肾脏，滤纸吸干血迹称质量备用。部分肾皮质使用4%中性甲醛固定，石蜡包埋制片，行苏木精—伊红(HE)染色；剩余部分迅速放于液氮冻存，行Western免疫印迹试验。

1.3.2 血、尿相关指标及体质量测定： 采用血糖分析仪检测空腹血糖(FPG)，放射免疫法检测空腹胰岛素(FINS)，使用双抗体夹心法检测24h尿白蛋白排泄率(UAER)，并测定大鼠体质量。

1.3.3 肾脏氧化应激指标检测： 上述肾脏组织生理盐水冲洗干净，剪碎后加入适量裂解液摇匀，采用南京建成生物公司生产的试剂盒检测MDA、总超氧化物歧化酶(T-SOD)水平，严格按照说明书操作。

表1 各组大鼠血、尿相关指标及体质量比较

1.3.4 胰岛细胞病理改变观察： 大鼠胰尾组织常规固定、切片(厚度2 μm)，HE染色，在光学显微镜下观察胰岛细胞组织形态学、结构变化。胰岛细胞凋亡：石蜡切片后，采用原味末端标记法(TUNEL)检测，并在光学显微镜下观察凋亡细胞，计算凋亡率(凋亡细胞核数目/总细胞核数目×100%)，具体操作严格按照说明书进行。

1.3.5 Western免疫印迹检测Nrf 2蛋白： 取液氮冻存的肾皮质，充分研磨、裂解、离心，4℃ 1 200 r/min离心10 min，取上清液提取总蛋白，制胶，电泳，将蛋白转至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，经5%脱脂牛奶封闭，加入兔抗Nrf 2多克隆抗体(1∶800)及GAPDH标准内参(1∶1 000)，4℃孵育过夜后，加入相应的二抗，室温下孵育1 h，加ECL显色，使用美国UVP分析仪扫描胶片，得到灰度值。

2 结 果

2.1 血、尿相关指标及体质量比较 DM组及AS-IV组大鼠FPG、UAER及体质量显著高于对照组，FINS显著低于对照组，差异均有统计学意义(P<0.01)；AS-IV组大鼠FPG、UAER及体质量显著低于DM组，FINS显著高于DM组，差异有统计学意义(P<0.01)，见表1。

2.2 肾脏氧化应激指标比较 DM组及AS-IV组大鼠MDA含量显著高于对照组，T-SOD活性显著低于对照组，差异均有统计学意义(P<0.01)；AS-IV组大鼠MDA含量显著低于DM组，T-SOD活性显著高于DM组，差异均有统计学意义(P<0.01)，见表2。

2.3 胰岛细胞病理改变比较 对照组大鼠胰岛轮廓清晰，胰岛细胞数目较多且大小一致、排列整齐；DM组大鼠胰岛轮廓不清，胰岛细胞数目较对照组显著减少，且出现肿胀、坏死及空泡变性，呈不规则排列；AS-IV组大鼠胰岛轮廓较为清晰，胰岛细胞数目较DM组有所增多，形态、排列较为规则，无明显坏死(图1见封3)。

表2 各组大鼠肾脏氧化应激指标比较

2.4 胰岛细胞凋亡情况比较 光学显微镜下观察凋亡的胰岛细胞核染色质浓缩，呈棕黄色，而未凋亡的细胞核染色质呈蓝色。TUNEL检测结果发现，对照组棕黄色细胞核数目较少，DM组棕黄色细胞核数目较对照组显著增多，AS-IV组棕黄色细胞核数目较DM组有所减少(图2见封3)。DM组及AS-IV组大鼠胰岛细胞凋亡率显著高于对照组(t=9.991、5.987，P=0.000)，AS-IV组大鼠胰岛细胞凋亡率显著低于DM组，差异均有统计学意义(t=6.952，P=0.000)，见图3。

注：与对照组比较，aP<0.01；与DM组比较，bP<0.01

2.5 Nrf 2蛋白表达 免疫印迹结果显示，DM组大鼠肾组织总Nrf 2、核Nrf 2蛋白表达显著低于对照组及AS-IV组(t=2.542、3.881、2.642、2.267，P=0.024、0.002、0.019、0.040)，AS-IV组大鼠肾组织总Nrf 2、核Nrf 2蛋白表达显著高于DM组，差异均有统计学意义(t=2.985、2.928，P=0.010、0.011)，见图4、5。

图4 各组大鼠肾组织总Nrf2、核Nrf2蛋白表达

注：与对照组比较，aP<0.05；与DM组比较，bP<0.05

3 讨 论

DM发病机制复杂，目前多认为是在遗传基础上多因素共同作用的结果。近年来，多项研究提示氧化应激反应中产生的ROS是引起DM发生、发展的关键因素，关于氧化应激反应的研究现已成为热点领域[6]。DM患者肾脏易受氧化应激反应影响，损伤肾组织细胞，破坏基质重构，导致组织纤维化及信号通路异常，从而促进DN的发生发展，加重肾脏损伤。机体内过多的ROS可攻击生物膜中多不饱和脂肪酸，形成MDA等脂质过氧化物，干扰机体新陈代谢[7-8]。T-SOD是具有抗氧化作用的小分子肽类物质。本研究中DM组及AS-IV组大鼠MDA含量显著高于对照组，T-SOD活性显著低于对照组，AS-IV组大鼠MDA含量显著低于DM组，T-SOD活性显著低于DM组，提示高脂饮食可导致机体内大量ROS蓄积，营养过剩从而诱发氧化应激反应，而给予AS-IV治疗可有效改善氧化应激反应，减轻肾脏损伤，与韩冬[9]研究类似。

AS-IV是以黄芪为原料的黄芪皂苷类单体成分，经药理研究证实对人体多脏器、多系统具有较好的保护作用，抗炎、降压、改善心肌缺血等方面作用显著[10-11]。据统计，在治疗糖尿病的处方中，黄芪使用率极高，从黄芪根中分离的多糖(APS-G)可双向调节血糖，降低葡萄糖负荷的小鼠血糖水平，改善抗肾上腺素导致的小鼠血糖升高反应[12]。涂祎珺等[13]研究报道，黄芪可有效提高血浆白蛋白水平，降低尿蛋白排出量，提供机体必需氨基酸，显著改善肾小球疾病导致的代谢紊乱，同时黄芪强大的降脂效果还可以防治肾小球硬化。肖峰等[14]研究发现，黄芪可有效抑制DM大鼠早期肾/体质量增加，降低大鼠高血糖。尚伟庆[15]采用中西医结合方法治疗肾病综合征患者的研究提示，黄芪可提高血浆白蛋白水平，降低24h尿蛋白定量，且AS-IV可促进H3亮氨酸合成肝脏蛋白，加速蛋白质合成。本研究DM组及AS-IV组大鼠FPG、UAER及体质量显著高于对照组，FINS显著低于对照组，AS-IV组大鼠FPG、UAER及体质量显著低于DM组，FINS显著高于DM组，与上述研究较为一致，认为AS-IV可有效改善DM大鼠血糖，减轻体质量，降低尿白蛋白排泄量，改善肾小球肥大及基质增生，从而发挥肾脏保护作用。

Nrf2是调节机体氧化应激反应的重要因子，正常情况下，可在机体各组织及细胞中表达，与Kelch样环氧丙烷相关蛋1(Keap1)结合形成二聚体在胞浆中存在，最后被泛素化降解，仅小部分稳定Nrf2可经磷酸化转位进入细胞核。并与ARE作用激活Nrf2-ARE通路，使Nrf2下游靶基因(抗氧化酶基因、Ⅱ相解毒酶基因)维持在基础表达水平，细胞趋于稳定状态。但氧化应激反应产生的ROS可使Nrf2磷酸化并与Keap1解离，转位入细胞核与ARE结合，激活Nrf2下游靶基因转录表达。Peng等[16]动物研究发现敲除大鼠Nrf2基因的氧化应激反应发生率更高，Nrf2基因缺失或激活障碍的大鼠氧化应激源细胞毒性更强，分析其原因学者们认为与慢性炎性反应及细胞凋亡相关。因而，可认为Nrf2-ARE通路对机体氧化应激反应、炎性反应及凋亡过程中具有较好的保护作用。

本研究Western免疫印迹结果显示，DM组、AS-IV组大鼠肾组织总Nrf2、核Nrf2蛋白表达显著低于对照组，AS-IV组大鼠肾组织总Nrf2、核Nrf2蛋白表达显著高于DM组，与前面提到的Nrf2-ARE通路的抗氧化应激、抗炎性反应作用相符。Vento等[17]研究发现，当ROS表达上调并超过Nrf2的抗氧化能力后，可提高Nrf2降解作用，降低Nrf2活性，从而导致严重的氧化应激损伤。基于此，笔者认为本研究DM组大鼠总Nrf2、核Nrf2蛋白低表达的原因可能是由于高糖高脂饮食下，ROS过多生成并蓄积，直接抑制Nrf2，导致其胞浆泛素化降解程度增加，入核减少，总蛋白、核蛋白均为低表达。而胰岛β细胞抗氧化酶基因、Ⅱ相解毒酶基因均为低表达，抗氧化应激及炎性反应作用较差[18-20]，DM组Nrf2蛋白低表达，可进一步减弱抗氧化酶基因、Ⅱ相解毒酶基因在胰岛β细胞中的表达，从而加重胰岛β细胞氧化应激损伤及炎性反应损伤。而AS-IV组总Nrf2、核Nrf2蛋白表达显著高于DM组，提示应用黄芪甲苷可激活Nrf2-ARE通路，减轻Nrf2泛素化降解程度，稳定其胞浆浓度，提高核转移活性，并上调抗氧化酶基因、Ⅱ相解毒酶基因的表达，从而提高对胰岛β细胞的保护作用，延缓胰岛β细胞凋亡。

综上所述，AS-IV有降低肥胖DM大鼠血糖、体质量，减少尿蛋白排泄的作用，同时还能减轻大鼠肾脏氧化应激反应，上调Nrf2蛋白表达，激活Nrf2-ARE通路，从而起到防止胰岛β细胞进一步损伤的作用。

利益冲突：无

作者贡献声明

刘文：设计研究方案，起草及修订论文；章尹岗、别志霞：资料搜集整理；解为慈、叶迎春：实施研究过程，收集和分析数据，论文审核