急性心肌梗死患者体内miR-208表达与心肌损伤、血小板活化的相关性分析

曹舸，余惠，范景秀，康慧，张尔永

急性心肌梗死是以冠状动脉斑块破裂、血小板活化、血栓形成为基本特点的心血管疾病，能够造成冠状动脉急性闭塞、心肌缺血损伤。在临床实践中，寻找能够早期反映心肌损伤的标志物有助于尽早识别心肌梗死，进而及时进行救治、改善预后[1]。微小RNA(microRNA，miRNA)是近年来发现的进化上高度保守的小分子RNA，分子量21～25 bp且不具备编码蛋白质的功能，主要的生物学功能是结合mRNA的3'-非编码区来调节基因表达并发挥多种生物学作用[2-3]。MiR-208是一族在心肌中高表达的miRNA，包括miR-208a、miR-208b 2种成员，参与心脏发育、心肌功能调控等过程；当心肌细胞发生破坏时，细胞内的miR-208会释放进入细胞外并成为能反映心肌损害程度的特异性指标[4]。现分析了急性心肌梗死患者体内miR-208表达变化与心肌损伤、血小板活化的相关性，报道如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择2014年6月—2017年12月四川大学华西医院心脏大血管外科确诊为AMI的患者64例作为AMI组，均符合AMI的诊断标准且入院时发病时间<3 h，排除合并恶性肿瘤、现症感染、肝肾功能不全的患者以及既往有心肌梗死、脑梗死病史的患者。64例中男38例，女26例，年龄39～63(56.51±7.62)岁；发病至入院时间(2.25±0.35)h；合并症：高血压29例，糖尿病24例，高脂血症37例。随机选择同期进行健康体检的志愿者52例作为对照组，男29例，女23例，年龄37～60(57.12±7.24)岁，既往均无心脏疾病且体检心电图正常。2组性别、年龄比较差异无统计学意义(P>0.05)。本研究经医院伦理委员会批准，患者及家属同意并签署知情同意书，具有可比性。

1.2 观察指标及方法

1.2.1 miR-208表达： 采用康为世纪公司的血液RNA提取试剂盒(CW0538S)提取外周静脉血中的RNA，而后采用miRNA cDNA第一链合成试剂盒(SW2142S)将RNA反转录合成为cDNA；取cDNA样本并按照miRNA荧光定量PCR检测试剂盒配置反应体系，进行PCR反应，反应体系见表1。miR-208b的上游引物序列为5’-AAUGCUAGCUAGCUAGCUA-3’，下游引物序列为5’-CUAGUCAUGCAUGCGUAGCA-3’。根据反应后计算机软件中生成的曲线读取Ct值，根据公式2-△△Ct计算miR-208a、miR-208b的表达量。

表1 PCR反应体系及步骤

1.2.2 心肌损伤指标： 采集外周静脉血后分离血清，应用南京建成公司的相应分子试剂盒进行操作，测定肌钙蛋白I(cTnI)、磷酸肌酸激酶同工酶(CK-MB)、丙二醛(MDA)、内皮素-1(ET-1)的含量，测定方法为放射免疫沉淀法。

1.2.3 血小板活化指标： 采集外周静脉血后分离血浆，应用Santa Cruz公司生产的PAC-1、P-selectin的荧光抗体进行标记，在流式细胞仪上测定PAC-1、P-selectin的含量，以阳性标记的血小板百分率表示；采用上海西唐公司生产的ELISA试剂盒测定血小板活化因子(PAF)和脂蛋白相关磷脂酶A2(Lp-PLA2)、血栓素B2(TXB2)的含量，测定方法为酶联免疫吸附法。

2 结 果

2.1 miR-208表达比较 与对照组比较，AMI组患者外周血中miR-208a表达升高(P<0.01)，miR-208b无显著变化(P>0.05)，见表2。

表2 2组血浆中miR-208a、miR-208b表达比较

2.2 心肌损伤指标比较 与对照组比较，AMI组患者血清cTnI、CK-MB、MDA、ET-1水平显著升高(P<0.01)，见表3。

表3 2组血清心肌损伤指标比较

2.3 血小板活化指标比较 与对照组比较，AMI组患者血清P-selectin、PAC-1、TXB2、PAF、Lp-PLA2含量升高(P<0.01)，见表4。

2.4 相关性分析 AMI组患者血浆中miR-208a的表达量与cTnI、CK-MB、MDA、ET-1、P-selectin、PAC-1、TXB2、PAF、Lp-PLA2的含量呈正相关(r=0.683、0.626、0.596、0.653、0.585、0.703、0.495、0.531、0.628，P=0.004、0.007、0.016、0.005、0.018、0.002、0.022、0.019、0.009)。

表4 2组血清血小板活化指标的比较

3 讨 论

急性心肌梗死治疗的关键是早发现、早诊断、早治疗。肌钙蛋白及心肌酶谱等临床上用于诊断心肌梗死的辅助检查指标具有较强的特异性，但在发病早期的灵敏度不佳，心肌梗死发生后较长时间才释放进入血液循环，当相应指标发生明显升高时多已出现了不可逆的心肌损害，进而延误了最佳的治疗时机。miR-208是近年来发现的具有心肌细胞特异性的一族miRNA，包括miR-208a和miR-208b 2种成员[5]。本研究通过分析发病3 h以内的AMI患者外周血miR-208表达量的变化可知：AMI组外周血中miR-208a的表达量较对照组升高，miR-208b的表达量与对照组比较无变化。结合2种miR-208的功能进行分析，miR-208b主要表达于胎儿的心肌组织，参与心脏发育过程并且表达量在成年后逐步减少；miR-208a主要表达于成人的心肌组织，参与心肌细胞内肌球蛋白重链及轻链结构的调节，对维持心肌细胞的正常舒缩功能具有重要意义[6]。本研究结果提示miR-208a在急性心肌梗死发生后的早期已经出现了高表达，通过测定外周血中miR-208a的表达量能够为AMI的早期识别提供依据。

心肌细胞在缺血缺氧的作用下发生损伤和破裂后，除了miR-208a的大量释放外，细胞内多种结构分子和功能分子也会大量释放。临床实验室对心肌损伤标志物的测定是直接检测蛋白含量，但蛋白成分复杂且存在相似的位点，实验室检测存在一定误差，尽管能够反映心肌损伤的程度、却无法在早期灵敏地识别疾病[7-8]。cTnI和CK-MB分别是心肌细胞内高度特异性的结构分子和功能分子，前者参与肌钙蛋白的组成、后者参与能量代谢的调控[9-10]；MDA和ET-1是心肌损害过程中继发性发生改变的分子，前者是缺氧后氧自由基大量生成并修饰脂质后形成的产物，后者是心肌梗死过程中内皮细胞破坏后的产物[11-13]。本研究对AMI患者外周血中以上心肌损伤标志物的分析发现：AMI组患者外周血中cTnI、CK-MB、MDA、ET-1的含量较对照组升高。结果提示AMI患者体内心肌的缺血缺氧损害会造成细胞内的多种分子释放增多；AMI组患者外周血中miR-208a的表达量与cTnI、CK-MB、MDA、ET-1含量呈正相关。由此说明miR-208a的高表达不仅能够为AMI的早期识别提供依据，还能准确反映和评估心肌缺血损害的程度。

AMI病程中血小板活化和聚集是重要的病理生理特征，冠状动脉内斑块破裂后血栓的形成依赖于血小板的活化和聚集[14-15]，miR-208a在心肌组织中不仅参与心肌细胞功能的调节，同时也被证实与血小板的功能有关。李恩等[16]研究报道，急性冠状动脉综合征患者体内miR-208a与血小板分布宽度及平均血小板体积有关，但AMI病程中miR-208a对血小板活化的影响仍有待进一步阐明。P-selectin、PAC-1、TXB2、PAF、Lp-PLA2是反映血小板活化的指标，本研究的分析发现：AMI组患者外周血中P-selectin、PAC-1、TXB2、PAF、Lp-PLA2的含量较对照组升高。进一步分析miR-208a高表达与血小板活化指标的关系可知：AMI组患者外周血中miR-208a的表达量与P-selectin、PAC-1、TXB2、PAF、Lp-PLA2的含量呈正相关。结合血小板活化指标进行分析，P-selectin、PAC-1是血小板表面与血小板活化直接相关的分子，前者在血小板活化后大量表达于血小板表面并且能够促进血小板在斑块破裂部位大量黏附，后者是活化的血小板表面高表达的受体、能够促进纤维蛋白原的结合及血栓的形成[17]。TXA2是花生四烯酸代谢过程中生成的具有促凝活性的产物，能够促进血小板发生聚集，TXB2是其代谢后生成的化学性质稳定的产物，能够反映TXA2的生成量[18]；PAF、Lp-PLA2是血小板聚集的诱导剂，两者间能够相互作用并共同促进血小板在斑块破损处发生聚集[19]。本研究的结果提示miR-208a的高表达与AMI患者体内血小板的过度活化有关，通过miR-208a表达量的测定能够评估血小板的活化程度。

综上所述，AMI患者外周血中miR-208a表达增多且与心肌损伤、血小板活化程度相关，可为疾病的早期识别以及心肌损伤、血小板活化程度的评估提供依据。

利益冲突：无

作者贡献声明

曹舸、张尔永：设计研究方案，实施研究过程，论文撰写；余惠：实施研究过程，资料搜集整理，进行统计学分析；范景秀、康慧：分析试验数据，论文审核