粪大肠菌群检测分析酶底物法

栾盛媛 张伟薇 张丽丽 张 振

（1黑龙江省同江市环境保护监测站 黑龙江同江 156400 2黑龙江省三江环境监测站 黑龙江同江 156400 3黑龙江省佳木斯市汤原县环境保护局 黑龙江佳木斯 154700）

1 方法原理

在特定温度下培养特定的时间，粪大肠菌群能产生酶底物法采用大肠菌群细菌能产生β－半乳糖苷酶，将选择性培养基中的无色底物邻硝基苯β－D－吡喃半乳甘糖分解黄色的邻硝基苯酚，在紫外灯照射下产生荧光。统计阳性反应出现的数量，查MPN图表，在将其计算出样品中粪大肠菌群的浓度值。其酶底物法检出限是 10MPN／L。

2 实验室用水

实验室用水为无菌水，取来适量的纯净水，放在烧杯中，经过121摄氏度，高压蒸汽灭菌，需要20分钟。

3 采样瓶的清洗准备

（1）是新购买的500ml具旋帽或者是磨口塞得广口玻璃瓶，应在百分之二的盐酸中浸泡几个小时，还需要用自来水冲洗干净，再用纯净水清洗1-2次，控干，备用。

（2）将清洗干净干燥的采样器，用专用的纸包裹起来，放入恒温干燥箱内，将温度设置到121摄氏度，灭菌20分钟，烘干。灭菌完成后，还需要关闭实验室电源待温度降到50摄氏度以下时，方可开门取样品瓶，不然，玻璃瓶会因为操作不当爆裂。

4 样品的采集及保存

（1）单独采样，优先采样。使用已经准备好的采样瓶，采样。在采样的过程中产样瓶不用再进行冲洗。

（2）在同一采样点进行分层采样时，应自上而下进行采样，以免不同层次的搅扰。

（3）水样的保存条件及时间：水样应在10摄氏度以下冷藏保存；应尽快分析，最长时间不能超过6个小时。

（4）化验员接样后，不能立即检测，应将样品与4摄氏度以下冷藏并在2小时内检测。

5 分析样品

5.1 样品稀释

需要根据样品污染程度确定接种量，避免接种样品培养后97孔定量盘出现全部阳性或全部阴性。在接种量小于100ml的时候，应稀释样品后再进行接种试验，接种量为10ml的时候，取10ml样品加入到90ml无菌水的三角瓶中混合均匀制成1:10的稀释样品，其他接种量的稀释样品依次类推。在未知样品，可选用多个接种量进行检测。

5.2 接种

量取100ml样品或是稀释样品与灭菌后的三角瓶，再加入2.7克+-0.5克培养基粉末，在充分搅拌混匀，等完全溶解，在将其全部倒入97孔定量盘内，以手扶平97孔定量盘背面，赶出孔内气泡，然后，用程控定量封口机封口。观察97孔定量盘颜色，若出现类似或者深于标准阳性比色盘的颜色，则还需要进行样品排查、培养基无菌水等一系列因素后，终止实验或重新实验。

5.3 培养

测定粪大肠菌群时，将封口后的97孔定量盘，放入恒温培养箱中，在44.5摄氏度+-0.5摄氏度下，培养24小时。

5.4 对照实验

（1）空白对照

每次实验都要用无菌水按照分析步骤进行实验室空白测定。培养后的97孔定量盘不得有任何颜色，不然，该实验失败，应重新测定。

（2）阳性与阴性对照

将粪大肠菌群标准菌株制成300-3000个／ml的菌悬液，将菌悬液按接种和培养要求操作，阳性菌株应呈现阳性反应；阴性菌株应呈现阴性反应；否则，结果无效，实验失败，重新测定。

（3）结果判读及计数和有效位数的要求

将培养24小时的97孔定量盘进行结果读数，样品出现变黄色判断为粪大肠菌群阳性。测定结果保留2位有效数字。

5.5 结果计算与表示

从97孔定量盘法MPN表中查的每100ml水样中粪大肠菌群的MPN值，在根据样品稀释度不同，按照公式换算样品中粪大肠菌群浓度。

结语

本文通过对粪大肠菌群检测方法酶底物法以其操作简便、检测周期短将在未来取代多管发酵法、滤膜法等传统方法，尤其是酶底物法采用密封培养技术。