海藻酸盐-壳聚糖/羟基磷灰石复合纤维敷料的制备及性能

张小林，黄 晨，靳向煜

(1. 江南大学 纺织服装学院，江苏 无锡 214122； 2. 东华大学 纺织学院，上海 201620)

海藻酸是从天然海藻中提取的一种线形多糖生物高分子材料，由β-D-甘露糖醛酸(M 单元)和α-L-古罗糖醛酸(G单元)两种组份组成，以M-M、G-G、M-G 等多种形式排列，是通过1～4糖苷键连接而成的嵌段聚合物[1]。海藻酸因具有高生物相容性、无毒性等优良性能，被广泛用于伤口敷料、药物释放及组织工程等领域。海藻酸大分子结构中G单元与Ca2+交联形成特殊的“egg-box”结构[2]，且相交联的Ca2+可与Na+和K+发生离子交换，形成水溶性的海藻酸盐。海藻酸钙纤维敷料用于创面治疗时，通过离子交换，从不溶性海藻酸钙转变成水溶性海藻酸钠，吸收大量液体呈凝胶状态，为伤口愈合提供相对安全润湿的环境[3]。尤其治疗洞穿性创面时，成凝胶性能可减少死腔，缓解病人疼痛症状，效果明显[4]。

国内外已展开对海藻酸盐纤维[5-7]的研究。文献[8]对海藻酸钙纤维基本性能，如表观形貌，物理参数及热、力学性能等进行了初步研究及表征。文献[1]研究制备高强度海藻酸盐纤维，并得出湿法纺丝的最佳工艺参数，同时表征纤维基本性能。文献[9-10]研究海藻酸盐纤维降解机理及影响降解性能因素，并对材料降解性能、力学性能、药物释放及抗菌性能作详细阐述。文献[11-13]以海藻酸为原料纺制微胶囊，将其作为药物载体，并植入动物体内做进一步病理学分析。文献[14]将不同相对分子质量的海藻酸钠高分子原料混合，控制相对分子质量大小来调节海藻酸盐凝胶的力学性能。目前主要以静电纺、湿法纺丝和冻干法制备海藻酸盐纤维支架等。

本文以海藻酸为主要原料并添加其他物质，通过微流纺纺制新型海藻酸盐复合纤维敷料，并对其降解性能、力学性能及生物毒性作评价，为后期用于伤口创面治疗提供参考。

1 试验材料与方法

1.1 试验材料

海藻酸钠(180947-100G，Sigma)；壳聚糖(Hyclone-SH30256，国药)；羟基磷灰石(C10068615，麦克林)；氯化钙(AR500ML，凌峰试剂)；乙醇(AR500ML，鸿盛)；去离子水；胰蛋白酶(0.25%，加拿大)；细胞培养液；磷酸缓冲液PBS(Hyclone-SH30256，国药)；噻唑蓝(MTT，美国)；二甲基亚砜(DMSO，美国)；人的成纤维皮肤细胞和角质化细胞。

1.2 试验仪器

扫描电子显微镜(S-4800型，日本)；高强高模纤维强伸度仪(XQ-1C型，上海新纤仪器公司)；18 kW转靶X射线衍射仪(D/max-2550VB-PC型，日本)；红外光谱仪(Nicolet 6700型，美国)；酶标仪(Synergy H1型，美国)；倒置显微镜(LEICA DMi1型，美国)。

1.3 海藻酸盐基纤维敷料制备方法

将海藻酸钠粉末溶于去离子水中，制备体积分数为3%的海藻酸钠溶液3份，并标为A、 B、 C。往A溶液中加入0.1 mg壳聚糖粉末，B溶液中加入0.1 mg羟基磷灰石粉末。已配制的海藻酸钠溶液A、 B、 C分别为芯层溶液，皮层溶液均为5%氯化钙乙醇溶液，通过自制微流纺设备[9]纺制3种类型海藻酸盐基纤维敷料，如表1所示。

表1 3种纤维芯-鞘流成分Table 1 Core-sheath ingredient of three kinds of fiber

1.4 海藻酸盐基纤维敷料性能测试

1.4.1 表面形态表征

先使用手感目测法对纤维敷料的外观形态进行感官评价，然后采用扫描电子显微镜对纤维表面形态做进一步观察。

1.4.2 溶胀性能

室温下将3种纤维敷料分别浸渍在磷酸盐缓冲液中，在固定时间间隔取出样品，用滤纸充分吸除纤维表面多余水分并称量，用溶胀率(式(1))来表示纤维溶胀性能。

溶胀率=[(ms-mi)/mi]×100%

(1)

式中：ms为纤维敷料溶胀后质量；mi为纤维敷料未溶胀前质量。

1.4.3 降解性能

室温下将3种纤维敷料分别浸渍在磷酸盐缓冲液中，在固定时间间隔取出样品，充分脱水干燥并称量，用质量损失率(式(2))来表示纤维降解性能。

我国设施农业技术推广的另一重要问题是缺乏资金的支持。设施农业技术的推广需要大量资金，设施农业在全国范围内推广效果欠佳，根本原因是农业技术创新度不够以及国内农业全面机械化需要不断的资金支持。由于地方和国家的财政部门对于技术推广没有足够的重视程度，在国家财政预算中未能将设施农业技术推广纳入其中，导致技术推广资金支持不足。

质量损失率=[(m0-m1)/m0]×100%

(2)

式中：m0为纤维敷料未浸渍前质量；m1为纤维敷料降解后质量。

1.4.4 红外光谱及X-射线衍射分析

采用红外光谱仪对纤维的光能团进行测试分析，采用X-射线衍射仪测定海藻酸盐纤维的结晶度。

1.4.5 力学性能测试

在标准环境(温度为(20±3)℃，相对湿度为(65±5)%)下，使用高强高模纤维强伸度仪对纤维的力学性能进行测试，拉伸隔距为10 mm，预加张力为0.5 cN，拉伸速度为20 mm/min。

1.4.6 生物毒性评价

(1) 细胞增殖试验。3种纤维敷料各取50 mg分别浸渍在50 mL细胞培养液中，放置在恒温箱中孵化5 d，过滤所制质量浓度为1 mg/mL的纤维浸提液。分别将人体皮肤成纤维细胞和角质化细胞按照5 000个/孔的浓度加入到96孔板中，在37 ℃和5%CO2培养箱中培养12 h。每孔加入100 μL试样液，空白组加入等体积培养基。在固定时间间隔内，每孔加入10 μL MTT培养3.5 h。用移液枪吸去孔内液体，每孔加入100 μL DMSO，于490 nm 测定吸光度[15-16]。细胞相对增殖率(RGR)=样品吸光度/空白组吸光度×100%。

(2) 细胞划痕试验。人体皮肤成纤维细胞和角质化细胞按照1×106个/孔的浓度接种到3 cm培养板，在37 ℃和5%CO2培养箱中培养。待细胞长到90%后，用20 μL吸液管分别在培养板中划痕，用移液枪吸去培养基，加入3 mL试样液，空白对照组加入等体积培养基。在固定时间间隔内取出培养板，用倒置显微镜观察细胞迁移情况。

2 结果与分析

2.1 海藻酸盐基纤维敷料的表面形貌特征

(a) SA

(b) SA-CS

(c) SA-HAP图1 海藻酸盐基纤维敷料的表面形态Fig.1 Morphological characterization of alginate-based fibrous dressings

2.2 海藻酸盐基纤维敷料的溶胀性能和降解性能

3种海藻酸盐基纤维敷料的溶胀性能和降解性能如图2所示。

(a) 溶胀性能

(b) 降解性能图2 3种海藻酸盐基纤维敷料的溶胀性能和降解性Fig.2 Swelling behavior and degradation of threetypes of alginate-based fibrous dressings

由图2(a)可知，海藻酸盐纤维呈现优异的溶胀性能，归因于纤维中含有大量的—OH和—COOH。纤维浸渍在磷酸盐缓冲液中，海藻酸盐纤维中β-D-甘露糖醛酸(M)大分子基团先吸收大量水分，当达到饱和状态时，纤维发生部分降解；此时α-L-古罗糖醛酸(G)大分子基团“egg-box”结构中与—COOH 交联的Ca2+和溶液中Na+/K+发生离子交换，吸收更多的水分，最终导致“egg-box”结构破裂，大量的水分子进入到大分子链中，导致纤维降解[9]。由图2可知，海藻酸盐-壳聚糖复合纤维及海藻酸盐-羟基磷灰石复合纤维的溶胀和降解性能均差于海藻酸盐纤维。羟基磷灰石嵌入并均匀覆盖在纤维表面，降低水分子浸入纤维内部的趋势，减弱纤维溶胀性能，进而减缓纤维降解过程。壳聚糖是一种线性阳离子聚合物，壳聚糖大分子链中的—NH2和海藻酸钙中的—COOH存在静电作用，可以减少海藻酸中—COOH与Ca2+的交联，降低了离子交换程度，导致海藻酸盐-壳聚糖复合纤维呈现较低的溶胀及降解性能[9]。

2.3 海藻酸盐基纤维敷料的力学性能

3种海藻酸盐基纤维敷料的力学性能随降解时间的变化如图3所示。

(a) 断裂伸长率

(b) 断裂强度图3 3种海藻酸盐基纤维敷料的力学性能随降解时间变化Fig.3 Mechanical performance of three types of alginate-basedfibrous dressings changes with degradation time

由图3可知，3种纤维敷料的断裂强度和断裂伸长率均随着降解时间增加而减小。降解速度越快，纤维敷料断裂强度损耗越大，3种纤维敷料断裂强度对应于其降解速度。羟基磷灰石覆盖在纤维敷料表面，使纤维敷料刚度增强，导致海藻酸盐-羟基磷灰石复合纤维敷料呈现最小断裂伸长率；壳聚糖大分子链中—NH2与海藻酸盐大分子链中的—COOH相交联，减少了—COOH与Ca2+交联，增加了纤维敷料柔度，导致海藻酸盐-壳聚糖复合纤维敷料比海藻酸盐纤维敷料呈现更大的断裂伸长率。

2.4 海藻酸盐基纤维敷料的红外光谱及X-射线衍射分析

3种海藻酸盐基纤维敷料的红外光谱和X-射线衍射光谱如图4所示。

(a) 红外光谱

(b) X-射线衍射光谱图4 3种海藻酸盐基纤维敷料的红外光谱和X-射线衍射光谱Fig.4 FTIR spectra and XRD patterns of three types ofalginate-based fibrous dressings

2.5 细胞增殖试验

医用海藻酸盐基纤维敷料的生物毒性评价极其重要，本试验采用人体皮肤成纤维细胞和角质化细胞，通过细胞增殖试验和迁移试验对纤维敷料的细胞毒性进行评价。3种纤维敷料浸提液处理的人体成纤维细胞和角质化细胞增殖试验结果分别如图5和6所示，其中Control为空白对照组。由图5和6可知，试验组中的OD 490值均大于对照组。由此可知，经3种纤维敷料浸提液处理过的人体皮肤细胞存活率和对照组相当，或略大于对照组。另外，海藻酸盐纤维敷料、海藻酸盐-壳聚糖复合纤维敷料及海藻酸盐-羟基磷灰石复合纤维敷料对应的人体成纤维细胞和角质化细胞的相对增长率均大于75%，根据细胞毒性评级标准[15-16](如表2所示)可证明材料无生物毒性。

(a) 细胞增殖

(b) 细胞相对增长率图5 3种纤维敷料浸提液处理的人体皮肤成纤维细胞增殖试验结果Fig.5 Results of fibroblasts proliferation treatedby three types of fibrous dressings extracted medium

(a) 细胞增殖

(b) 细胞相对增长率图6 3种纤维敷料浸提液处理的人体皮肤角质化细胞增殖试验结果Fig.6 Results of keratinocytes proliferation treatedby three types of fibrous dressings extracted medium

表2 细胞毒性评级标准Table 2 Cytotoxicity grading criteria

(续 表)

2.6 细胞迁移试验

体外模拟人工划痕试验用于表征材料对细胞迁移性能影响，以进一步评价材料对细胞的毒性。3种纤维敷料对人体皮肤成纤维细胞和角质化细胞迁移性能影响如图7和图8所示，其中Control为空白对照组。由图7可知，经3种纤维敷料浸提液处理过的划痕，24 h后已长满90%，与空白对照组中的细胞迁移速率基本相同。由图8可知，经试验组和对照组浸提液处理的划痕，72 h后长满90%。人工模拟细胞划痕试验表明，海藻酸盐-壳聚糖复合纤维敷料及海藻酸盐-羟基磷灰石复合纤维敷料对人体皮肤细胞没有明显细胞毒性，相比空白对照组而言，试验组浸提液处理过的细胞迁移速率基本相同。

(a) 0 h

(b) 12 h

(c) 24 h图7 3种纤维敷料浸提液处理过的人体皮肤成纤维细胞划痕试验结果Fig.7 Results of fibroblast migration in the scratched fibroblast free area after treated bythree types of fibrous dressings extracted medium

(a) 0 h

(b) 24 h

(c) 72 h图8 3种纤维敷料浸提液处理过的人体皮肤角质化细胞划痕试验结果Fig.8 Results of keratinocyte migration in the scratched keratinocyte free area after treated by threetypes of fibrous dressings extracted medium

3 结 语

本文采用自制微流纺丝设备制备3种海藻酸盐基纤维敷料，并通过溶胀率、质量损失率和力学性能等测试，结果表明，海藻酸盐-壳聚糖复合纤维敷料和海藻酸盐-羟基磷灰石复合纤维敷料比纯海藻酸盐纤维敷料具有更慢降解速率及更强力学性能。由此表明，芯层流中壳聚糖或羟基磷灰石颗粒的加入可延缓纤维敷料降解周期，增强纤维敷料力学性能。另外，人体皮肤成纤维细胞和角质化细胞增殖试验及迁移试验结果表明，3种复合纤维敷料均无细胞毒性，可为后期治疗伤口创面提供理论参考依据。