雅连炮制工艺研究及不同炮制品中7个生物碱的含量测定＊

吴晓青，时晓媞，任瑶瑶，蒋合众，魏 屹，谭 睿

（西南交通大学生命科学与工程学院 成都 610031）

黄连因其性味苦寒，临床上多用其炮制品，自古以来，黄连炮制品的记载较多，炮制品种类多达24种，最早记载可见于南北朝的《雷公炮炙论》。《中华人民共和国药典》（2015 版）收载黄连片、酒黄连、姜黄连、萸黄连四种炮制品[1]。酒制能引药上行，缓和寒性，清头目之火；姜汁制能增强止呕的作用；吴茱萸汁制能增强清气分湿热之力。《中华人民共和国药典》（2015版）检测小檗碱、巴马汀、黄连碱和表小檗碱，并规定炮制辅料的用量但炮制温度和时间等未有明确的规定，在实际操作中存在较大的主观随意性，导致炮制品质量的参差不齐，因此，对黄连炮制工艺中关键操作点及关键条件进行优化是十分必要的。现有文献报道中，关于黄连的炮制工艺多以味连为研究对象[2-9]，雅连为黄连中的珍品[10-11]，课题组研究表明：其总生物碱的含量与疗“消渴”相关，加之雅连相对于味连质地较疏松，因而味连的炮制工艺并不适用于雅连，因此，本研究拟以总生物碱含量作为主要指标，对雅连的炮制工艺进行研究，并对不同炮制品中的7 个生物碱进行含量测定。以期形成规范的炮制工艺，建成雅连的质量控制体系，为中药饮片炮制规范和质量标准的制定探索有益的经验。

1 材料

Angilent1260-II 型高效液相色谱仪；BS-110S 电子分析天平（北京赛多利斯电子天平有限公司）；超声波清洁器（昆山市超声仪器有限公司）。

格陵兰黄连碱、表小檗碱、药根碱、黄连碱、巴马汀购于成都普思生物科技有限公司（批号分别为PS161130-03、PS161130-01、PS161124-01、PS161201-01、PS161130-02，含量≥98%）非洲防己碱购于成都曼斯特生物科技有限公司（批号为MUST-14072213，含量≥98%）、盐酸小檗碱购于中检院（批号为110713-200911，含量≥98%）。甲醇、乙腈（色谱纯，sigma）；三乙胺、磷酸、十二烷基苯磺酸钠、磷酸二氢钾均为分析纯。雅连购于四川省洪雅县瓦屋山药业，经西南交通大学宋良科教授鉴定为毛茛科植物三角叶黄连Coptis.deltoidea的干燥根茎。吴茱萸购自于北京本草方源药业有限公司（产地：云南），经西南交通大学生命科学与工程学院宋良科教授鉴定为吴茱萸Euodia rutaecarpa（Juss.）Benth.。生姜经西南交通大学生命科学与工程学院宋良科教授鉴定为姜科植物姜Zingiber officinaleRosc.的新鲜根茎。黄酒购自绍兴吴越酿酒有限公司酿造（批号：20150926）。

表1 因素水平表

表2 雅连炮制工艺正交试验设计及结果

表3 方差分析表

表4 正交验证试验结果（n=2）

2 方法与结果

2.1 炮制工艺研究

2.1.1 正交试验设计

黄连生物碱在炮制过程中，含量呈现先下降后升高的趋势，100℃时含量升高，在160℃含量达到最高，小檗碱在超过160℃含量开始下降，分解为小檗红碱，240℃时小檗红碱与小檗碱含量相等，表小檗碱在170℃时已无法检出，黄连碱在240℃时无法检出，同时出现许多未知峰。因此，选择炒制，考察因素为闷润时间（A）、辅料稀释倍数（B）、炮制温度（C）、炮制时间（D），本着节能省时的原则，根据《中华人民共和国药典》（2015 版）以及《四川省中药饮片炮制规范》（2010版）每个因素各取3 水平，按4 因素3 水平正交表进行正交实验，以黄连总生物碱含量[12]作为指标，优选炮制工艺。因素水平表见表1。

2.1.2 酒雅连

取黄酒3 份，分别不稀释、稀释2 倍、稀释4 倍，取净制的雅连100 g，各9 份，按表2 分别编号1-9，按各试验号条件，将黄酒或相当于原黄酒质量12.5 g 的稀释后的黄酒喷洒在雅连上，混匀后加盖，闷润，待酒被吸收后，按规定的温度，清炒相应的时间，放凉，50 目筛筛去灰屑，打粉，过2 号筛，测定总生物碱含量[12]，筛选最佳炮制工艺。

为了验证上述炮制工艺的稳定性和可重复性，以保证此工艺的合理可靠，称取雅连药材约100.0 g，共3份，按上述确定的工艺条件，进行重复3 次的验证试验，实验结果见表4。

验证试验结果表明：此工艺具有可重复性，故确定优选的工艺为A2B1C1D2。

2.1.3 姜雅连

称取生姜，置于研钵中，加水研磨2 次，用纱布过滤，合并滤液，分别制成每1 mL 相当于1 g、0.5 g、0.25 g生姜的姜汁。取净制的雅连100 g，各9 份，按表5 分别编号1-9，按各试验号条件，将相当于12.5 g 生姜的姜汁喷洒在雅连上，混匀后加盖，闷润，待滤液被吸收后，按规定的温度，清炒相应的时间，放凉，50 目筛筛去灰屑，打粉，过2 号筛，测定总生物碱含量[12]，筛选最佳炮制工艺。

表5 姜黄连炮制工艺正交试验设计及结果

结果表明：影响姜黄连炮制工艺的各因素依次顺序为：A 闷润时间＞D 炮制时间＞B 辅料稀释倍数＞C 炮制温度（表5）。经方差分析，因素A 闷润时间对炮制效果均有显著性影响，故优选的炮制工艺条件为：A3B3C2D1，即每100 g雅连加相当于12.5 g生姜的0.25 g/mL的姜汁，闷润3 h，130℃清炒5 min（表6）。

表6 方差分析表

为了验证上述炮制工艺的稳定性和可重复性，以保证此工艺的合理可靠，称取雅连药材约100.0 g，共3份，按上述确定的工艺条件，进行重复3 次的验证试验，实验结果见表3-7。

验证试验结果表明：此工艺具有可重复性，故确定优选的工艺为A3B3C2D1。

表7 正交验证试验结果（n=2）

2.1.4 萸雅连

称取吴茱萸，加水煎煮2 次，用纱布过滤，分别浓缩成每1 mL 相当于1 g、0.5 g、0.25 g 吴茱萸的水煎液。取净制的雅连100 g，各9 份，按表8 正交表分别编号1-9，按各试验号条件，将相当于10 g 吴茱萸生药材的吴茱萸水煎液喷洒在雅连上，混匀后加盖，闷润，待液体被吸收后，按规定的温度，清炒相应的时间，放凉，50 目筛筛去灰屑，打粉，过2 号筛，测定总生物碱含量[12]，筛选最佳炮制工艺。

结果表明：影响萸雅连炮制工艺的各因素依次顺序为：D 炮制时间＞C 炮制温度＞B 辅料加量＞A闷润时间（表8，表9）。经方差分析，因素A 闷润时间、B 辅料加量对炮制效果均无显著性影响，C 炮制温度、D 炮制时间对炮制效果有显著性影响，结合节能省时的原则，故优选的炮制工艺条件为：A1B2C3D1，即每100 g雅连加相当于10 g吴茱萸生药材的0.5 g·mL-1的吴茱萸水煎液，闷润1 h，160℃清炒5 min（表3-9）。

为了验证上述炮制工艺的稳定性和可重复性，以保证此工艺的合理可靠，称取雅连药材约100.0 g，共3份，按上述确定的工艺条件，进行重复3 次的验证试验，实验结果见表3-10。

验证试验结果表明：此工艺具有可重复性，故确定优选的工艺为A1B2C3D1。

表8 萸雅连炮制工艺正交试验设计及结果

表9 方差分析表

2.2 雅连不同炮制品中7个生物碱的含量测定

2.2.1 色谱条件

色谱柱Angilent Eclipse XDB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm；流动相为乙腈-0.4%磷酸二氢钾（含有0.4%十二烷基磺酸钠，0.6%三乙胺，磷酸调节pH 9.0）水溶液（34：66）；流速1.0 mL·min-1；柱温35℃；检测波长345 nm；进样量10 μL。

2.2.2 对照品溶液的制备

分别精密称定7 个对照品适量，加盐酸甲醇溶液（1:100），溶解制得每1 mL含有1 mg的对照品储备液。精密吸取各对照品储备液适量，配制成每1 mL分别含格陵兰黄连碱、表小檗碱、非洲防己碱、药根碱、黄连碱、巴马汀、小檗碱为0.026、0.043、0.030、0.031、0.019、0.029、0.067 mg·mL-1的混合对照品溶液。

2.2.3 供试品溶液的制备

取雅连生品及各炮制品粉末约0.1 g（过三号筛），精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入25 mL盐酸甲醇（1：100），密塞，称定重量，超声提取45 min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，放置，取上清液，过0.45 μm微孔滤膜，即得供试品溶液。

2.2.4 方法学考察

（1）线性关系考察

分别精密吸取1.2.2项下各对照品储备溶液，用盐酸甲醇（1:100）溶液分别稀释成一系列浓度的混合对照品溶液。按1.2.1色谱条件注入高效液相色谱仪，记录峰面积，以峰面积Y 为纵坐标，进样量（μg）为横坐标，回归分析，得回归方程、相关系数（r）及线性范围，见表2。结果表明，Groenlandicine、药根碱、非洲防己碱、表小檗碱、黄连碱、巴马汀、小檗碱，7 个生物碱分别在0.052 73-1.055（r=0.999 8）μg，0.085 76-1.715（r= 0.999 9）μg，0.051 38 - 1.028（r= 0.999 9）μg，0.038 45 - 0.769 0（r= 0.999 9）μg，0.038 41 - 0.768 2（r= 0.999 9）μg，0.057 - 1.141 0（r= 0.999 9）μg，0.1342-2.684（r=0.999 9）μg，呈良好的线性关系。

（2）精密度试验

精密吸取同一混合生物碱对照品溶液，按1.2.1项色谱条件注入高效液相色谱仪，重复进样6次，记录峰面积值，计算RSD。各生物碱峰面积RSD 分别为0.97%、0.63%、0.84%、0.56%、0.54%、0.76%，表明方法有较好的精密度。

（3）稳定性试验

取雅连样品0.1 g，精密称定，按1.2.3 项下方法制备供试品溶液，分别于0、2、4、8、12、24 h 时间按1.2.1项下色谱条件注入高效液相色谱仪，记录峰面积，计算RSD 值。峰面积的RSD 分别为1.11%、1.17%、2.89%、0.60%、0.33%、1.40%、0.63%，说明供试品溶液在24 h内稳定可用。

（4）重复性试验

取0.1 g 的雅连样品6 份，精密称定，按1.2.3 项下方法制备供试品溶液，按1.2.1项下色谱条件注入高效液相色谱仪，记录峰面积，计算含量，计算RSD 值。所测含量的RSD 分别为1.74%、1.58%、1.90%、2.16%、2.01%、2.17%、1.64%，结果表明供试品溶液的制备方法重复性良好。

（5）加样回收率试验

取雅连样品6 份，精密称定，每份0.1 g，分别精密加入等量的混合对照品溶液，按1.2.3项方法制备供试品溶液，按1.2.1 项色谱条件进样，计算加样回收率。格陵兰黄连碱、药根碱、非洲防己碱、表小檗碱、黄连碱、巴马汀、小檗碱平均回收率分别为97.07%、99.26%、101.60、99.43、98.62%、98.67%、98.68%，RSD

分别为1.07%、0.66%、0.47%、0.47%、0.27%、0.37%、0.29%。表明本法具有较好的回收率。

（6）样品测定

分别取同一批次净制的雅连药材12份，每份100 g，取3 份直接打粉，过2 号筛，3 份按“2.1.2”项下酒黄连炮制法炮制，3 份按“2.1.3”项下姜黄连炮制法炮制，3份按“2.1.4”项下萸黄连炮制方法炮制，炮制后，均打粉，过2 号筛，上述12 份黄连样品按2.2.3 项下方法制成供试品溶液，按2.2.1项下色谱条件，进样测定，计算7个生物碱含量及总生物碱含量（表11）。

表10 正交验证试验结果（n=2）

表11 雅连生品及炮制品生物碱含量（%）

结果表明，总生物碱含量：萸雅连＞姜雅连＞生品＞酒雅连；小檗碱含量：姜雅连＞萸雅连＞生品＞酒雅连；巴马汀含量：萸雅连＞姜雅连＞酒雅连＞生品；黄连碱含量：生品＞萸雅连＞姜雅连＞酒雅连；表小檗碱含量：生品＞萸雅连＞姜雅连＞酒雅连；非洲防己碱含量：生品＞姜雅连＞萸雅连＞酒雅连；药根碱含量：生品＞姜雅连＞萸雅连＞酒雅连；格陵兰黄连碱含量：生品＞萸雅连＞姜雅连＞酒雅连。

3 讨论

雅连传统上一直被公认为是质量最优的佳品黄连，其疗效受到中医药界广泛的推崇;《唐本草》中记载：“黄连，蜀道者粗大节平，味极浓苦，疗渴为最”。本课题组研究证实：炮制后酒雅连的总生物碱含量降低，姜雅连和萸雅连总生物碱含量升高，萸雅连总生物碱含量最高，可能与加入吴茱萸炮制相关，吴茱萸中亦含有生物碱类化合物。萸雅连降糖效果最佳，优于二甲双胍。

本文对7个生物碱成分炮制前后的含量测定结果表明：姜雅连和萸雅连炮制后小檗碱、巴马汀含量升高。小檗碱和巴马汀是黄连降糖、降脂的有效成分，与雅连疗“消渴”直接相关。降雪[13]等研究发现，小檗碱的含量在160℃时含量达到最高，超过160℃开始分解为小檗红碱；巴马汀的含量在160℃达到最高，超过160℃含量开始下降；黄连碱在160℃含量达到最高，240℃完全降解；表小檗碱在170℃就已完全降解；药根碱的含量几乎不受温度影响。在原生物碱分解的过程中，生成了许多新的成分，这些成分有些也具有其独特的活性，因此，在筛选炮制工艺时，应充分考虑到黄连的不同药理作用，以及不同黄连生物碱的不同活性以及活性的大小，依据不同作用需要来权重黄连多种生物碱降解或保留。同时，要考虑炮制对药性缓和的作用，充分考虑减毒增效。