碱性土上GF677 与毛桃叶片叶绿素合成及叶绿体结构差异性研究

宋海岩，陈 栋，李 靖，钟小江，杨文渊，祝 进，江国良*

(1.四川省农业科学院园艺研究所·农业部西南地区园艺作物生物学与种质创制重点实验室，四川 成都 610066;2.宜宾县农业局果树站，四川 宜宾 644600; 3.四川省园艺推广总站，四川 成都 610016)

【研究意义】四川盆地是我国桃主要栽培地区之一。近年来，受早春干旱、夏季暴雨以及长期的土壤养分消耗因素影响，龙泉山脉和川中丘陵产区桃树黄化现象有愈演愈烈趋势，部分桃园黄化植株比例高达90 %，对桃产量和品质影响较大，已成为当地桃产业健康发展的重要限制因子之一[1-2]。GF677 (P.amygdalus×P.persica)桃砧木由法国INRA(Institut Nationaldela Recherche Agronomique)于20世纪60年代杂交选育而成，根系发达，长势健壮，树冠高大与桃/油桃品种间嫁接亲和力强，并具有抗钙质碱性土缺铁性黄化、耐重茬、耐旱等优良特性[3]。目前关于GF677的研究主要集中于组培快繁技术上[4-11]，为GF677的大规模推广提供了生产条件，但是GF677作为栽培所需的桃砧木品种，其抗盐碱能力及引入国内的适应性表现应该是我们需要研究的主要内容，尤其是在盐碱地或重茬园区的研究，这对开展桃砧木抗性育种具有重要意义。【前人研究进展】郁万文等人[12-13]对GF677在盐胁迫和淹水胁迫下的表现研究表明：不同树种/品种的桃砧耐盐性排序为蒙古扁桃>山桃>GF677>毛桃>甘肃桃>陕甘山桃>筑波5号>毛樱桃，同时GF677抗水淹能力也一般。但是GF677在四川盆地石灰性紫色土地区栽培条件下表现出极强的抗黄化特性。【本研究切入点】本试验对GF677在石灰性紫色土上叶片叶绿素合成及叶绿体结构进行对比研究。【拟解决的关键问题】以期找出其叶绿素代谢和叶绿体结构差异，为未来抗性桃砧木育种中优良亲本的筛选和选择提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料与试验地点

供试材料为抗性桃砧木GF677(扦插苗)，以普通毛桃(实生苗)为对照。

1.2 试验方法

选取生长势一致的GF677与毛桃实生苗，单株为1重复，每个处理设置5个重复。自3月10日起每隔1个月左右从每株树上选取树冠各方位、无病虫害新梢中部成熟功能叶10片，拍照后放入液氮带回实验室进行生理生化指标测定及叶绿素合成前体含量测定。

叶绿素a、叶绿素b、类胡萝卜素含量：使用丙酮法，参照李合生等[15]。

叶绿素各合成前体含量测定：5-氨基酮戊酸(ALA)含量、胆色素原PBG含量参照D Mauzerall[16]等人方法；Mg-ProtoⅨ、ProtoⅨ、Pchl使用碱性丙酮提取法，参照刘和平[17]等人方法；UrogenⅢ含量测定参照杨清等人[18]的方法。

2 结果与分析

2.1 不同时期叶片叶绿素各组分含量变化

由图1可知，碱性土上不同时期GF677叶片和毛桃叶片叶绿素a含量均呈现先下降后上升最后又下降的趋势，但毛桃在受到碱胁迫后叶绿素a含量下降幅度更大，导致整个生长期毛桃叶片叶绿素a含量始终低于GF677，7月29日至9月29日叶绿素a含量的上升可能与GF677和毛桃对碱性土壤的适应所致。在5月5日和5月27日至9月29日之间GF677叶绿素a含量均极显著(P<1 %)高于毛桃，GF677叶片叶绿素a含量最低值出现在5月27日，最高值出现在7月29日，而毛桃叶片叶绿素a含量最高值出现在5月5日，最低值出现在7月29日。

由图2可知，碱性土上GF677叶片叶绿素b含量呈现先下降后迅速上升然后又下降最后再略微上升的趋势，在5月5日和5月27日至9月29日之间叶绿素b含量均极显著(P<1 %)高于毛桃，叶绿素b含量最低值出现在5月5日，最高值出现在5月27日，而毛桃叶片叶绿素b含量呈现先上升后下降然后又上升最后再下降的趋势，最高值出现在5月5日，最低值出现在9月29日。GF677叶绿素b含量在5月5日略微下降后能够迅速恢复，毛桃在受到碱胁迫后叶片叶绿素b含量下降极为显著，因此推测毛桃在碱性土上的黄化可能与叶片叶绿素b含量的下降有关。

图中**表示该时期同一指标在P<1 %水平上差异显著，*表示该时期同一指标在P<5 %水平上差异显著，下同** in the picture indicators in P<1 % significant level in the same period and * in the picture indicators in P<5 % significant level in the same period，the same as below图1 碱性土上GF677和毛桃不同时期叶片叶绿素a含量变化Fig.1 Content of chla in leaves of GF677 and wild peach on alkaline soil during different periods

图2 碱性土上GF677和毛桃不同时期叶片叶绿素b含量变化Fig.2 Content of chlb in leaves of GF677 and wild peach on alkaline soil during different periods

由图3可知，碱性土上GF677叶片类胡萝卜素(Cx·c)含量呈现先上升后下降然后又上升最终趋于平缓的趋势，其中在3月10日测定时GF677叶片Cx·c含量显著(P<5 %)低于毛桃叶片，然而之后GF677叶片Cx·c含量呈现更明显的增加趋势，并在5月5日显著(P<5 %)高于毛桃叶片，随后GF677叶片Cx·c含量呈现更明显的下降趋势，在5月27日和6月29日GF677叶片Cx·c含量极显著(P<1 %)低于毛桃，最低值出现在3月10日，毛桃叶片类胡萝卜素含量最低值也出现在3月10日。6月29日后GF677与毛桃叶片类胡萝卜素的上升可能与叶片的成熟与衰老有关。

由图4可知，碱性土上GF677叶片叶绿素总量变化呈现先下降后上升最后又下降的趋势，其中在3月10日和5月27日至9月29日均极显著(P<1 %)高于毛桃叶片，叶绿素总量最低值出现在5月5日，最高值出现在7月29日。而毛桃叶片叶绿素总量呈现先略微上升后下降然后又上升最后再下降的趋势，最高值出现在5月5日，而最低值出现在7月29日。

图3 碱性土上GF677和毛桃不同时期叶片类胡萝卜素含量变化Fig.3 Content of carotenoid in leaves of GF677 and wild peach on alkaline soil during different periods

图4 碱性土上GF677和毛桃不同时期叶片叶绿素总量变化Fig.4 Content of total chlorophyll in leaves of GF677 and wild peach on alkaline soil during different periods

由图5可知，碱性土上GF677叶片叶绿素a/叶绿素b比值变化呈现先上升后下降然后又上升最后再下降的趋势，在5月5日显著(P<5 %)低于毛桃，在5月5日至7月29日和9月29日均极显著(P<1 %)低于毛桃，最低值出现在5月27日，最高值出现在9月2日。而毛桃叶片叶绿素a/叶绿素b比值呈现先下降后上升然后又下降最后再上升的趋势，最低值出现在5月5日，最高值出现在9月29日，9月29日出现最高值可能与毛桃叶片的衰老及叶绿素b的分解有关。

2.2 不同时期叶片叶绿素合成前体含量变化

图6为被子植物体内叶绿素合成途径，在叶绿素合成的15个步骤中，关键步骤包括Glu(Glutamate,谷氨酸)→ALA(Aminolevulinic acid, 氨基酮戊酸)→PBG(Porphobilinogen, 胆色素原)→Uro (Uroorphyrinogen, 尿卟啉)→Proto(Protoporphyrin, 原卟啉)→Mg-Proto (Mg-Protoporphyrin, 镁原卟啉)→Pchl(Protochlorophyll, 原叶绿素酸)→Chla(Chlorophyll a,叶绿素a)→Chlb (Chlorophyll b, 叶绿素b)，其中任何一步受阻都将影响叶绿素的生物合成[19-24]，选取6种关键物质对其含量进行动态测定。

图5 碱性土上GF677和毛桃不同时期叶片叶绿素a/b比值变化Fig.5 Ratio between chla and chlb in leaves of GF677 and wild peach on alkaline soil during different periods

箭头旁阿拉伯数字代表调控该步骤的酶The arrow next to the Arabic numerals indicators regulatory enzyme in the process图6 被子植物叶绿素合成途径(参考Beale,2005)Fig.6 The chlorophyll biosynthesis pathway in angiosperms(quoted from Baele 2005)

由图7可知，碱性土上GF677叶片5-氨基酮戊酸含量(ALA)呈现先下降后上升的趋势，5月5日第一次测定时略微低于毛桃叶片ALA含量，但差异不显著，之后下降到5月27日显著(P<5 %)低于毛桃，6月29日至7月29日继续下降并极显著(P<1 %)低于毛桃，最低值出现在7月29日，之后随着毛桃叶片ALA含量的下降，在9月2日至9月29日GF677叶片ALA含量极显著(P<1 %)高于毛桃叶片。而毛桃叶片ALA含量呈现先上升后下降的趋势，最高值出现在6月29日，这可能与该时期叶片黄化及ALA代谢受阻有关。

图7 碱性土上GF677和毛桃不同时期叶片5-氨基酮戊酸含量变化Fig.7 Content of 5-aminolevulinic acid in leaves of GF677 and wild peach on alkline soil during different periods

图8 碱性土上GF677和毛桃不同时期叶片胆色素原含量变化Fig.8 Content of PBG in leaves of GF677 and wild peach on alkline soil during different periods

由图8可知，碱性土上GF677与毛桃叶片胆色素原(PBG)含量均呈现先上升后下降然后又上升的趋势，最高值都出现在7月29日，但略有不同，在5月27日至6月29日间GF677叶片PBG含量显著(P<5 %)高于毛桃叶片。

由图9可知，碱性土上GF677叶片内尿卟啉Ⅲ(UrogenⅢ)含量呈缓慢上升趋势，且一直极显著(P<1 %)高于毛桃，而毛桃叶片内UrogenⅢ含量呈现先上升后略微下降的趋势，毛桃与GF677叶片内各种叶绿素合成前体由尿卟啉Ⅲ开始出现较大差异。

图9 碱性土上GF677和毛桃不同时期叶片尿卟啉原Ⅲ含量变化Fig.9 Content of UrogenⅢ in leaves of GF677 and wild peach on alkline soil during different periods

图10 碱性土上GF677和毛桃不同时期叶片原卟啉Ⅸ含量变化Fig.10 Content of ProtoⅨ in leaves of GF677 and wild peach on alkaline soil during different periods

由图10可知，碱性土上GF677与毛桃叶片原卟啉Ⅸ含量均呈现先上升后下降然后又上升最后再下降的趋势，在5月27日至9月29日5个时期均极显著(P<1 %)高于毛桃，GF677叶片原卟啉Ⅸ含量最低值出现在3月10日，最高值出现在7月29日，而毛桃叶片原卟啉Ⅸ含量最低值出现在7月29日，最高值出现在5月5日。

由图11可知，碱性土上GF677叶片镁原卟啉Ⅸ含量呈现先上升后略微下降然后再上升最后又下降的趋势，在5月27日至9月29日均极显著(P<1 %)高于毛桃，GF677叶片镁原卟啉Ⅸ含量最低值出现在3月10日，最高值出现在7月29日，而毛桃叶片镁原卟啉Ⅸ含量呈现先略微上升后下降然后又上升最后再下降的趋势，最低值出现在7月29日，最高值出现在5月5日。

由图12可知，碱性土上GF677叶片原脱植基叶绿素(Pchl)含量呈现先上升后下降然后又上升最后再下降的趋势，虽然在3月10日第一次测定时GF677叶片Pchl含量显著低于毛桃，而在5月27日至9月29日均极显著(P<1 %)高于毛桃，最低值出现在3月10日，最高值出现在7月29日，而毛桃叶片原脱植基叶绿素含量呈现先略微上升后下降然后又上升最后再下降的趋势，最高值出现在5月5日，最低值出现在7月29日。

图11 碱性土上GF677和毛桃不同时期叶片镁原卟啉Ⅸ含量变化Fig.11 Content of Mg-ProtoⅨ in leaves of GF677 and wild peach on alkaline soil during different periods

图12 碱性土上GF677和毛桃不同时期叶片原脱植基叶绿素含量变化Fig.12 Content of Pchl in leaves of GF677 and wild peach on alkaline soil during different periods

2.3 叶片叶绿素各组分及叶绿素前体间相关性分析

图13为叶绿素a/b间循环路径图[13]，表1为GF677、毛桃叶片叶绿素各组分及叶绿素前体间相关性分析。基于图6高等植物叶绿素合成途径，推测对于正常植株体内这些叶绿素组分(除类胡萝卜素)与其合成前体的变化应该呈现正相关关系，然而根据对碱性土上GF677和毛桃叶绿素各组分及合成前体之间相关性分析(表1)发现，毛桃在这几个步骤中的PBG→Uro和Uro→Proto出现负相关系数-0.413和-0.148，其余步骤均呈正相关系数。而GF677在这几个步骤中的PBG→Uro过程相关系数为-0.908，达显著负相关(P<5 %)，在Uro→Proto和Chla→Chlb这两个步骤相关系数分别为-0.599和-0.391，其余步骤均呈正相关系数。结合对各叶绿素组分及合成前体含量的分析结果(图7～12)，推测毛桃在PBG向Uro合成步骤及Uro向Proto合成步骤转化受阻，而GF677与毛桃叶绿素合成前体含量开始出现较大差异正好从Uro开始，并且毛桃叶片内Uro含量始终极显著低于GF677。而结合叶绿素a/b间循环途径，我们推测GF677叶片内叶绿素前体合成受阻时Chla能够向Chlb转化一部分，从而保证正常生长所需的Chlb含量，而毛桃Chla降低时Chlb随之而明显降低，这可能是GF677在Chla→Chlb步骤出现负相关性的原因。

3 讨 论

植物在受到盐碱胁迫时叶片叶绿素代谢会受阻，叶绿素合成某些前体(如ALA、PBG等)会积累在植物体内[26]。GF677叶片叶绿素a含量、叶绿素b含量以及叶绿素总量在均大于毛桃，尤其是GF677在受到碱胁迫时叶片叶绿素b含量可以看到先下降后又重新增加，而毛桃叶片叶绿素b合成在受阻后在5月27日至7月29日均极显著(P≤1 %)低于GF677，表明在受到碱胁迫后，GF677叶片叶绿素b合成途径没有受到阻碍，而毛桃叶绿素b含量下降可能是其叶片出现黄化的主要原因。而贾俊丽等人[27]对桑树斑叶突变体的叶绿素合成特性研究表明突变体叶片黄化部分的叶绿素a、叶绿素b和类胡萝卜素含量均有不同程度的下降，其中叶绿素a的减少最显著，可能是导致突变体叶色黄化的直接原因，并未分析叶绿素a、b之间可能存在的联系以及叶绿素b与突变体叶色黄化之间的关系。

Chl.叶绿素; Chlide.脱植基叶绿素;CS.叶绿素合酶; Chlase.叶绿素分解酶; CAO.叶绿素加氧酶; CBR.叶绿素b还原酶; CAR.叶绿素a还原酶Chl.chlorophyll; Chlide.chlorophyllide;CS.chlorophyll synthase; Chlase. chlorophyllase; CAO.chlorophyllide a oxygenase; CBR.chlorophyll(ide) b reductase; CAR.hydroxy-chlorophyll(ide) a reductase图13 叶绿素循环(参考W. Rüdiger，2002)Fig.13 The chlorophyll cycle(quoted from W. Rüdiger，2002)

对碱性土上GF677和毛桃叶片叶绿素合成前体进一步研究发现，毛桃叶片ALA含量在受到碱胁迫后会先上升后下降，在叶片内出现积累，UrogenⅢ含量一直极显著低于GF677，表明其ALA向PBG转化步骤及PBG向Uro转化步骤在受到碱胁迫时受阻。王颖等人[28]和孙锦等人[29]对菠菜在盐胁迫下的叶绿素合成前体研究也表明PBG向Uro转化步骤在受到盐胁迫时受阻。张丽等人[30]对盐碱胁迫下番茄幼苗叶绿素合成前体的影响也表明PBG向Uro转化步骤受阻，喷施Spd后可缓解部分步骤。而GF677叶片内ProtoⅨ、Mg-ProtoⅨ以及原脱植基叶绿素含量在受到碱胁迫后短时间下降之后又重新升高，表明GF677在碱性土上具有更强的适应能力，在受到碱胁迫后能在较短时间内调整叶绿素前体的合成。

结合对各叶绿素组分及合成前体含量的分析结果，认为毛桃在PBG向Uro合成步骤及Uro向Proto合成步骤转化受阻，而GF677与毛桃叶绿素合成前体含量开始出现较大差异正好从Uro开始，毛桃叶片内Uro含量始终极显著低于GF677，表明PBG向Uro步骤及Uro向Proto步骤对桃砧木抗黄化能力的差异分化具有重要意义。调控这几个步骤的关键酶[31]是：羟甲基后胆色素原合酶(hydroxymethylbilane synthase)[胆色素原合酶脱氨酶(Porphobilinogen deaminase)]、尿卟琳原Ⅲ合酶(uroporphyrinogenⅢ synthase)[尿卟琳原Ⅲ共合酶(uroporphyrinogenⅢ co-synthase)]、尿卟琳原脱羧酶(uroporphyrinogen decarboxylase)、粪卟琳原氧化脱羧酶(coproporphyrinogen oxidative decarboxylase)、原卟琳原氧化酶(protoporphyrinogen oxidase)，对这些酶以及调控这些酶相关基因的表达进行探究，将会为我们进一步了解GF677抗黄化机制提供依据。

表1 GF677、毛桃叶片叶绿素各组分及叶绿素前体间相关性分析

注：以对角线为界，右上方为GF677，左下方为毛桃，*表示相关性达0.05显著性水平，**表示相关性达0.01显著性水平，下同。

Notes: The upper right is on behalf of GF677 and the bottom left is on behalf of wild peach,divided by a diagonal line.* indicators inP≤5 % significant level,**indicators inP≤1 % significant level,the same as below.

Chla和Chlb之间的相互转化称为“叶绿素循环”，在不同生理条件下调控它们之间的比值具有重要的意义[32]。Klein等人[33]认为质体核糖体反应中心新生肽(RCs)对叶绿素a有更高的亲合性，叶绿素b是由叶绿素a氧化而来,所以当RCs不再整合叶绿素a时,富余的叶绿素a才有部分氧化成叶绿素b。部分叶绿素a合成的减少，将会扩大对叶绿素b合成的抑制[34]，导致叶绿素a/b比值升高，这与本试验中观察到的毛桃叶片内叶绿素a、叶绿素b合成同时受到抑制相一致。叶绿素b减少也会导致光合单元减少和叶绿体类囊体膜的发育不良。GF677叶片内叶绿素前体合成受阻时叶绿素a含量短暂降低时叶绿素b含量反而会上升，据此推测GF677叶片内叶绿素前体合成受阻时Chla能够向Chlb转化一部分，从而保证正常生长所需的Chlb含量，这可能是GF677在Chla→Chlb步骤出现负相关性的原因。而毛桃Chla降低时Chlb随之而明显降低。结合图13，今后对调控Chla→Chlb转化的中间产物(7-羟甲基叶绿素酸脂a、叶绿素酸脂a、叶绿素酸脂b等)及相关酶(CAO，CS，Chlase等)活性的分析将有助于进一步探究毛桃调控毛桃叶片Chla→Chlb受阻的原因。

4 结 论

本研究以抗性桃砧木资源GF677和普通毛桃为试验材料，比较其在碱性土上叶绿素合成途径各个步骤的前体及组分含量差异，并分析其组分间相关系数。最终发现：①在5-10月份多数测定时期，碱性土上GF677叶片叶绿素a、叶绿素b、叶绿素总量及UrogenⅢ、ProtoⅨ、Mg-ProtoⅨ和原脱植基叶绿素含量均高于毛桃；GF677叶片内叶绿素b、ProtoⅨ、Mg-ProtoⅨ以及原脱植基叶绿素含量在受到碱胁迫后能在短时间内恢复甚至超越前期值，而毛桃叶片叶绿素a、b合成受阻后急剧下降，结合对各叶绿素组分及合成前体含量的分析结果，因此毛桃叶绿素b含量下降可能是其叶片黄化的主要原因。②植物叶绿素合成PBG→Uro、Uro→Proto两个步骤，及叶绿素循环中叶绿素a→叶绿素b转化是否受阻是桃砧木抗黄化能力的重要判断指标。本试验为今后桃砧木育种工作中的筛选高铁吸收效率亲本提供了基础性工作。