基于网络药理学预测葛根解肌退热的作用机制Δ

2019-01-17高思佳王莹莹杨玉雪周雪林赵艳玲

中国医院用药评价与分析 2018年12期

高思佳，王丹，王莹莹，杨玉雪，徐卓，张璐，周雪林，赵艳玲

(1.成都中医药大学药学院，四川成都 611137； 2.解放军总医院第五医学中心药学部，北京 100039； 3.浙江中医药大学药学院，浙江杭州 310053； 4.首都医科大学基础医学院药理学系，北京 100069)

葛根为豆科植物野葛Puerarialobata(Willd.)Ohwi的干燥根，性凉，味甘辛，具有解肌退热、生津止渴、透疹、升阳止泻、通经活络和解酒毒等功效[1]。首载于《神农本草经》，“葛根主身大热、消渴”；《本草纲目》中也有关于葛根的记载，“葛，起阴气、解诸毒，主治诸弊、身大热、消渴”。葛根的解肌退热和生津止渴作用为其最重要的功效。葛根多用于治疗外感发热头痛、项背强痛、口渴、消渴、麻疹不透、热痢、泄泻、眩晕头痛、中风偏瘫、胸痹心痛及酒毒伤中等[1]。发热是一种常见的机体防御性反应，是机体正气与病邪相争或者体内阴阳失调的结果，主要包括外感发热和内伤发热[2]。外感发热是致病因素与人体正气相互作用的结果，外界环境的变化、外邪伤害和机体正气的盛衰是外感发热病发病的关键因素，阳热盛极则壮热不已；若邪热耗伤人体阴精、津血，使阳盛阴虚，则发热迁延。内伤发热的基本病机为体内脏腑功能失调，气血阴阳失衡[3]。现代药理学研究结果表明，长期发热或高热持续不退，可导致细胞代谢增强，进一步升高耗氧量，使心率加快，增加心输出量；炎症反应诱发的炎性因子可增加耗氧量，加速肌肉分解，导致消瘦[4]。此外，发热时中枢神经系统兴奋，可能导致头痛、头晕；持续发热又可抑制神经系统，导致嗜睡或者昏迷等。本研究拟通过网络药理学方法，探讨葛根解肌退热的作用机制，进一步分析其作为常用解表药治疗发热的合理性及针对性，以期为后续实验研究及临床用药提供参考依据。

1 资料与方法

1.1 葛根药物靶点的筛选

通过中药系统药理学数据库和分析平台(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP)(http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php/)获得葛根所含的化学成分结构，再依据相似性比对中草药活性成分数据库(herbal ingredients’ targets database，HIT)(http：//lifecenter.sgst.cn/hit/)[5]和治疗靶点数据库(therapeutic target database，TTD)(http：//bidd.nus.edu.sg/group/cjttd/)[6]进行靶点筛选，建立葛根药物靶点数据集。

1.2 发热相关疾病靶点的筛选

通过人类孟德尔遗传综合数据库(online mendelian inheritance in man，OMIM)(http：//www.omim.org/)[7]筛选发热相关疾病靶点，建立发热相关靶点数据集。以上人类的靶点连接蛋白通过交互蛋白数据库(database of interacting protein，DIP)(http：//dip.doembi.ucla.edu)获得。将以上靶点转化为UniProt数据库识别码形式。

1.3 “成分-靶点-疾病”网络的构建及分析

为了更合理地阐明葛根中被鉴定的活性成分与发热靶点之间的关系，将葛根活性化学成分、成分相关靶点、发热相关疾病靶点和交互蛋白靶点连接成“化学成分-靶点-疾病”网络。将所得网络导入Cytoscape 3.6.0软件进行可视化分析，并分析各靶点的相关拓扑参数。以点度中心性、中介中心性和接近中心性3个拓扑参数为筛选有效作用靶点的依据。

1.4 京都基因与基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)通路注释分析

将“1.3”所得直接作用靶点的UniProt数据库识别码导入功能注释工具DAVID 6.8中进行KEGG通路注释分析，得出交互网络中的直接作用靶点相关作用通路。

2 结果

2.1 葛根成分靶点和发热疾病靶点的筛选

通过TCMSP数据库共筛选出葛根中13个化学活性成分，203个蛋白靶点，10个发热相关作用靶点，522个交互蛋白，以上靶点将进一步用来构建“成分-靶点-疾病”网络。

2.2 葛根解肌退热的“成分-靶点-疾病”网络的构建与分析

为了更清晰直观地阐释葛根解肌退热的复杂网络关系，本研究通过网络药理学方法构建“成分-靶点-炎症”交互网络，并进一步通过分析该网络中各靶点的拓扑参数值，筛选出较为重要的关键蛋白靶点和相关的信号通路。图1展示了葛根解肌退热的“成分-靶点-疾病”交互网络，图中，三角形为药物/成分，菱形为药物/成分靶标，六边形为疾病靶标，圆形为与靶标存在相互作用的蛋白质，正方形为药物/成分直接作用的疾病靶标。选取该图中所有直接作用靶点，并计算其拓扑参数点度中心性、中介中心性和接近中心性，结果见表1。图2展示了葛根解肌退热的“成分-靶点-疾病”交互作用网络中与直接作用靶点直接相连靶点交互网络，进一步简化了“成分-靶点-疾病”交互网络，凸显了葛根中化学成分的直接作用靶点的相关网络关系；图中，三角形为药物/成分，六边形为疾病靶标，圆形为与靶标存在相互作用的蛋白质，正方形为药物/成分直接作用的疾病靶标；包含了12个化学成分，1个非直接药物作用靶点，2个非直接发热作用靶点和11个交互蛋白。图3展示了葛根中化学成分与直接作用靶点的交互关系，图中，正方形为药物/成分直接作用的疾病靶标，三角形为药物/成分。

图1 葛根解肌退热的“成分-靶点-疾病”交互网络Fig 1 “Ingredients-target-disease” interactive network of radix puerariae in treatment of fever

2.3 KEGG通路注释分析

基于以上分析结果，筛选出8个直接作用靶点作为本次KEGG通路注释分析的参与靶点。将符合筛选条件的直接作用靶点呈递到DAVID数据库(http：//david.abcc.ncifcrf.gov/)进行KEGG通路注释分析。结果显示，共筛选出10条信号通路，部分通路与炎症反应相关，见表2、图4。

3 讨论

网络药理学是基于网络数据库，通过计算机方法整合大量生物学信息来分析预测不同节点之间关联性的综合学科[8]。其优势在于可从蛋白、分子和基因等多层面揭示药物对机体的作用及其机制，使研究具有靶向性。中药具有多成分、多靶点的特征，而网络药理学这种多靶点、多途径和多层次的评价系统方法在中药的研究中有较好的预测作用，更加切合中医药的学术特点和实际情况，为解决现代中药研究的热点问题发挥了巨大的作用[9-10]。

表1 葛根解肌退热的直接作用靶点拓扑参数分析Tab 1 Topological parameter analysis on direct targets of radix puerariae in treatment of fever

图2 葛根解肌退热的“成分-靶点-疾病”交互作用网络中与直接作用靶点直接相连靶点交互网络Fig 2 Target-interactive network directly connected to a direct target in “Ingredients-target-disease” interactive network of radix puerariae in treatment of fever

图3 葛根解肌退热的“成分-直接作用靶点”交互网络Fig 3 “Ingredients- direct target” interactive network of radix puerariae in treatment of fever

本研究通过网络药理学方法，初步探讨了葛根解肌退热的作用靶点及其可能机制。结果显示，“Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator”(囊性纤维化跨膜调节因子)、“Prostaglandin G/H synthase 2”(前列腺素G/H合酶和环氧酶2)、“C-C motif chemokine 2”(C-C基序趋化因子2)、“Interleukin-1 beta”(白细胞介素1β)、“Prostaglandin G/H synthase 1”(前列腺素G/H合酶和环氧酶1)、“Glial fibrillary acidic protein”(胶质细胞原纤维酸性蛋白)、“Tyrosine-protein kinase BTK”[酪氨酸蛋白激酶(PTK)]和“Interleukin-6”(白细胞介素6)为葛根解肌退热的直接作用靶点。其中，“ProstaglandinG/Hsynthase1”(前列腺素G/H合酶和环氧酶1)、“ProstaglandinG/Hsynthase2”(前列腺素G/H合酶和环氧酶2)是催化花生四烯酸转化为前列腺素的关键酶，非甾体抗炎药即以其为基础发挥解热镇痛作用[11]。查阅文献并结合本实验的KEGG通路富集结果，葛根可以通过“TNFsignalingpathway”(肿瘤坏死因子信号通路)、“NOD-likereceptorsignalingpathway”(核苷酸结合寡聚化结构域样受体信号通路)和“NF-kappaBsignalingpathway”(核转录因子κB信号通路)等通路发挥解肌退热作用。