补肾益气方药对心衰大鼠胰岛素抵抗及PKB、脂联素蛋白表达的影响＊

王瑶瑶，陈昱江，杨 茂，陈云志

（1.广州中医药大学第二临床医学院 广州510403；2.贵州中医药大学第一附属医院贵阳550001；3.贵州中医药大学基础医学院 贵阳550025）

心力衰竭（Heart Failure，HF）是一种复杂的临床综合征，主要表现为心脏泵血不能满足机体组织器官的需要[1]。心力衰竭已成为我国心血管领域的重要公共卫生问题，随着年龄增长，老年患者心力衰竭的发病率及死亡率也随之增高[2]。近年来研究发现，胰岛素抵抗（insulin resistance，IR）与心力衰竭的风险增加密切相关[3]，因此改善心力衰竭胰岛素抵抗的治疗是目前医学研究的重点。

中医认为HF的病位虽然在心，但人体是一个统一的有机整体，心脏受损可累及五脏，如心阳虚损，穷必极肾。陈可冀[4]认为，慢性心衰最根本的病机为内虚，早期主要为心气心阳亏虚，瘀血内停；中期脾阳受损，水湿内停；后期肾阳虚衰，水饮泛滥。心肾阴阳之间存在着密切的关系，心之阳气有赖肾阳资助，心阳虚日久及肾，肾阳不足致心失温养，故心衰治疗常要补肾益气。前期基础研究[5]发现益气活血方药能一定程度逆转心衰大鼠的IR并改善心室重构，但补肾益气方药对心衰胰岛素抵抗的研究未见报道，故本研究进一步探讨补肾益气方药对心衰大鼠胰岛素抵抗的影响作用及分子机制，为中医药治疗心力衰竭具有多靶点作用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验用药

补肾益气方药由淫羊藿20 g、黄芪20 g、党参15 g、麦冬10 g、五味子10 g组成，药材混合后加700 mL水浸泡半小时，滤出煎液，再加300 mL水煎煮，煮沸后半小时滤出，将两次滤液悬蒸浓缩成1∶2煎液，每毫升含生药2 g，储存于玻璃瓶，4℃保存备用，以上中药均购于贵阳同济堂药店。盐酸阿霉素（购于上海伊卡生物技术有限公司，产地：美国，规格：25 mg/瓶，CAS号：25316-40-9，MDL号:MFCD00077757）；卡托普利（生产企业：常州制药厂有限公司，规格：25 mg*100片/盒，国药准字H32023731）。

1.1.2 实验试剂及主要仪器

胰岛素试剂盒（产地：瑞典，购于北京优尼康生物科技有限公司，规格：96 wells）；实时荧光定量聚合酶链反应（Real-time PCR）试剂购自宝生物工程有限公司，TRNzol总RNA提取试剂购自天根生化科技（北京）有限公司，引物设计由赛默飞世尔科技完成；蛋白激酶B（PKB/AKT）和脂联素蛋白抗体购自康为世纪有限公司。电泳仪、蛋白电泳槽、蛋白转印系统（BIO-RAD公司），酶标仪（北京新风机电）；凝胶成像系统（仪器型号：Tanon 1600，上海天能科技有限公司）、荧光定量PCR仪（仪器型号：ABI7500，Applied Biosystems）。

1.1.3 实验动物造模及分组

清洁级10周龄Wistar雄性大鼠60只，体重200-250 g（长沙市天勤生物技术有限公司，动物合格证号：43006700008480），将其随机分为空白对照组、模型组、心力衰竭模型+卡托普利组、心力衰竭模型+补肾益气方药低剂量组、心力衰竭模型+补肾益气方药中剂量组、心力衰竭模型+补肾益气方药高剂量组。心力衰竭模型组及药物组分别予阿霉素腹腔注射，阿霉素剂量按每次20㎎·㎏-1溶于注射用水0.5 mL中，腹腔注射，隔天1次，共6次，总剂量为120㎎·㎏-1于2周内注射，给药期间大鼠出现精神萎靡，懒动，饮食量降低，竖毛，气喘，吐粉红色泡沫等体征[6]。造模成功后（心脏超声检测射血分数，以EF<45%为模型成功），药物组分别给予灌胃。卡托普利组：将卡托普利充分溶解于蒸馏水中，按照25 mg/（kg·d)比例配置，2 mL/只灌胃;补肾益气方高剂量组给予8 g/（kg·d）、补肾益气方中剂量组给予6 g/（kg·d）益、补肾益气方低剂量组给予4 g（kg·d），2 mL/只灌胃，连续给药2周；正常组和模型组给予同体积蒸馏水灌胃。

1.2 方法

1.2.1 空腹血糖、空腹胰岛素测定与胰岛素敏感指数计算

给药结束后，禁食12 h，内眦静脉窦取血3 mL，3000 r·min-1离心15 min，收集上清，低温冰箱保存备用。空腹血糖（FBG）测定用葡萄糖氧化酶法测定，空腹胰岛素（FINS）用放射免疫法测定。胰岛素抵抗（IR）的指标用由美国NIH肺、心脏血压研究所的Katz于2000年提出的胰岛素敏感指数（ISI）表示：ISI=ln[1/(FBG*FINS)]。

1.2.2 Western blot方法检测PKB/AKT、脂联素蛋白表达

从-80℃冰箱中取各组大鼠的心脏、骨骼肌和肝脏组织，尽可能剪碎，进行蛋白裂解、匀浆，4℃离心机3000 r，15 min，提取上清，用BCA法及酶标仪测定各样本吸光值，计算各样本蛋白含量；根据检测的目的蛋白分子量大小，选择不同的分离胶浓度，SDS-PAGE分离胶的浓度进行SDS-PAGE灌胶，然后将样本及预染标准品蛋白加入及电泳系统、裁剪合适大小的PVDF膜，并包含目的蛋白分子量条带的凝胶，置于滤纸之上；将PVDF膜与凝胶对齐并去除气泡，再盖上滤纸和海绵垫，合上夹子；将夹子放入转移槽中，冰水浴，加入电转液，220MA恒流，低温转膜2 h。转膜结束后，用一步法快速WB试剂盒进行免疫反应，ECL化学发光和曝光显影，最后用凝胶图像处理系统分析目的蛋白分子量和净光密度值。

1.2.3 RT-PCR实验检测PKB（AKT1）mRNA、脂联素（Adipoq）mRNA

各组样本加入RNAiso Plus，室温放置5 min；加1/5RNAiso Plus体积量氯仿混匀，冰上放置5 min；12000 r·min-14℃离心15 min，取上清于另一离心管中；加入等体积异丙醇，冰上放置10 min；12 000 r·min-14℃离心10 min，弃上清；向沉淀加入75%乙醇1 mL洗涤，12000 r·min-1，4℃离心5 min，弃上清，干燥沉淀；加入适量RNase-free水溶解沉淀，按照M-MLV RTase cDNA Synthesis试剂盒说明书配制反应体系，反应条件为37℃15 min，85℃5 s，逆转录合成cDNA。按照SYBR Master Mixture试剂盒说明书配制PCR反应液及设置反应条件，进行实时定量PCR检测，β-actin作为内参，同时设RT质控和PCR扩增两个空白对照。根据目的基因与内参基因的Ct差值得出各组相应指标mRNA的相对表达量（表1）。

表1 各基因引物系列

1.2.4 统计学方法

采用SPSS 20.0软件（IBM，Armonk，NY，USA）。先用Kolmogorov-Smirnov test检验是否符合正态分布，符合正态分布实验数据用均数±标准差（M±SD）表示，两两间比较运用pos-thoc Student-Newman-Keuls test检验。以P<0.05为差异有统计学意义，P<0.01为差异有显著统计学意义。

2 结果

2.1 补肾益气方药对FBG、FIS与ISI的影响

与空白对照组比较，模型组空腹血糖（FBG）、空腹血清胰岛素（FIS）显著升高（P<0.01），胰岛素敏感指数（ISI）显著降低，统计学具有显著差异（P<0.01）；经药物治疗后，与模型组相比，补肾益气方药各剂量组与卡托普利组空腹血糖（FBG）变化不明显、空腹血清胰岛素（FIS）均明显降低（P<0.05），胰岛素敏感指数（ISI）均明显升高，其中卡托普利组及补肾益气方药高剂量组空腹血清胰岛素（FIS）显著降低（P<0.01），卡托普利组胰岛素敏感指数（ISI）升高，统计学有显著性差异（P<0.01）（表2）。

表2 补肾益气方药对FBG、FIS与ISI的影响（xˉ响气方药）

2.2 补肾益气方药对心脏、肝脏和骨骼肌PKB/AKT1、脂联素蛋白表达的影响

模型组大鼠心脏、肝脏和骨骼肌中PKB/AKT1、脂联素蛋白的表达的灰度值较对照组明显降低（P<0.001），卡托普利组心脏、肝脏和骨骼肌中PKB/AKT1、脂联素蛋白的表达的灰度值较模型组明显升高，各中药组心脏、肝脏和骨骼肌中PKB/AKT1、脂联素蛋白的表达的灰度值逐渐升高，以补肾益气方药高剂量组灰度值升高较为明显（图1，图2，图3）。统计学分析：与空白对照组比较，模型组PKB、脂联素蛋白表达水平显著下降（P<0.01），与模型组比较，补肾益气方药各剂量组及卡托普利组蛋白表达水平明显升高（P<0.01，P<0.05）（表3）。

图2 肝脏PKB/AKT1、脂联素蛋白的蛋白表达

图3 骨骼肌PKB/AKT1、脂联素蛋白的蛋白表达

2.3 补肾益气方药对心脏、肝脏和骨骼肌PKBmRNA、脂联素mRNA的影响

与空白对照组比较，模型组PKB、脂联素蛋白表达水平显著下降（P<0.01），与模型组比较，补肾益气方药各剂量组及卡托普利组蛋白表达水平明显升高（P<0.05，P<0.01），高剂量组及卡托普利组PKB、脂联素蛋白表达明显升高（P<0.01）（表4）。

图1 心脏PKB/AKT1、脂联素蛋白的蛋白表达

表3 心脏、肝脏、骨骼肌中脂联素、AKT1蛋白表达（±s）

表3 心脏、肝脏、骨骼肌中脂联素、AKT1蛋白表达（±s）

注：与N组比较，**P<0.01；与M组比较，▲▲P<0.01，▲P<0.05。

组别空白对照组模型组卡托普利组补肾益气方药低剂量组补肾益气方药中剂量组补肾益气方药高剂量组n 10 10 10 10 10 10心脏脂联素1.359±0.027 0.341±0.027**1.085±0.042 0.578±0.027▲▲0.633±0.040▲▲1.061±0.031▲▲△△AKT1 1.256±0.026 0.324±0.023**1.099±0.042 0.493±0.044▲▲0.532±0.029▲▲0.859±0.026▲▲△△肝脏脂联素1.337±0.017 0.312±0.011**1.087±0.053 0.644±0.030▲▲0.672±0.016▲▲0.750±0.028▲▲△△AKT1 1.353±0.030 0.334±0.024**1.246±0.024 0.651±0.025▲▲0.686±0.042▲▲0.850±0.024▲▲△△骨骼肌脂联素0.836±0.024 0.200±0.018**0.699±0.031 0.338±0.024▲▲0.420±0.024▲▲0.553±0.026▲▲△△AKT1 0.0939±0.023 0.415±0.019**0.850±0.030 0.441±0.026▲0.508±0.039▲▲0.747±0.032▲▲△△

表4 心脏、肝脏、骨骼肌中脂联素mRNA、AKT1 mRNA表达（±s）

表4 心脏、肝脏、骨骼肌中脂联素mRNA、AKT1 mRNA表达（±s）

注：与N组比较，**P<0.01；与M组比较，▲▲P<0.01，▲P<0.05；与P组比较，△△P<0.01，△P<0.05。

组别空白对照组模型组卡托普利组补肾益气方药低剂量组补肾益气方药中剂量组补肾益气方药高剂量组n 10 10 10 10 10 10脂联素mRNA心脏6.70±1.11 1.05±0.56**5.65±0.71▲▲1.71±0.23▲▲3.69±0.72▲▲4.20±0.55△△肝脏6.86±1.12 0.80±0.28**5.33±0.38▲▲1.87±0.45▲▲3.49±0.80▲▲4.34±0.59△△骨骼肌5.47±0.73 0.68±0.24**4.59±0.66▲▲1.75±0.42▲▲2.52±0.57▲▲3.55±0.68△△AKT1mRNA心脏6.87±1.65 0.82±0.37**5.30±1.25▲▲1.97±0.47▲▲3.58±0.92▲▲4.16±0.88△肝脏6.33±1.41 0.90±0.28**5.45±0.79▲▲1.93±0.33▲▲3.50±0.70▲▲4.52±0.63△骨骼肌5.53±1.32 0.88±0.20**4.66±0.47▲▲1.44±0.35▲▲3.73±0.97▲▲3.97±0.62△

3 讨论

充血性心力衰竭在中医属“心痹”、“心悸”、“喘证”、“痰饮”、“水肿”等范畴，其病机主要为本虚标实，以心肾阳虚为本，血脉瘀滞、水饮内停、痰浊不化为标。心阳与肾阳之间有着密切的关系，心之阳气有赖肾阳资助，心阳虚日久可累及肾阳，肾阳不足致心失温养，故中医治疗本病常从补肾益气着手[7]。胰岛素抵抗是心力衰竭发生发展的危险因素。心衰时胰岛素抵抗发生的分子机制主要有胰岛素信号通路转导障碍及相关脂肪细胞因子的表达异常等原因。本研究发现补肾益气方药可能通过改变磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）/蛋白激酶B（PKB）信号通路及脂肪细胞因子的表达，有效改善心衰时的胰岛素抵抗。

心肌细胞内胰岛素信号传导通路的激活是心力衰竭发生胰岛素抵抗的重要机制[8]。胰岛素抵抗（IR）是由于胰岛素靶器官对内源性或外源性胰岛素的敏感性和反应性降低，导致靶器官细胞内的糖、脂质及蛋白质代谢障碍而出现的一系列综合征。心血管系统也是胰岛素作用的靶器官，胰岛素抵抗可引起微血管病变、外周动脉功能障碍、血流受阻、高血压、心肌细胞和内皮细胞功能障碍，从而增加冠状动脉阻塞、卒中和心力衰竭的危险因素，IR与心血管疾病密切相关。磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）/蛋白激酶B（PKB）信号通路是胰岛素信号转导最主要的途径[9]。胰岛素与心肌细胞膜上的胰岛素受体（InsR）结合后，可以激活胰岛素受体底物-1（IRS-1），活化的IRS-1继续激活PI3K，使其下游的信号分子PKB磷酸化，完成心肌细胞内胰岛素的信号传导[10]。当磷脂酰肌醇-3-羟激酶/蛋白激酶B（PI3K-PKB）信号通路受阻时，可诱导心肌细胞线粒体内的氧化应激及心肌细胞凋亡，导致心衰的发生。脂肪因子失调也是胰岛素抵抗的一个重要特征。脂联素是脂肪细胞分泌的一种细胞因子，具有增强胰岛素敏感性，降低胰岛素抵抗，减少心肌损害，改善心衰发展过程中心脏结构和功能的作用[11]。脂联素能有效调节血清脂质水平，降低血糖，保护心血管，抑制动脉粥样硬化。脂联素还可以抑制血管内皮细胞黏附分子的表达和分泌，如肿瘤坏死因子，从而降低胰岛素抵抗[12]。前期实验研究发现心衰大鼠存在胰岛素抵抗（IR），因此选择心衰大鼠的心脏、肝脏和骨骼肌作为目标组织，以PI3K-PKB信号传导通路及脂肪因子分泌改变作为切入点观察补肾益气方药对心衰IR的作用机制。胰岛素抵抗是心衰发生发展的重要危险因素，高胰岛素抵抗状态可能通过胰岛素的促生长作用导致心脏重塑和心室功能障碍加重心衰，且与PI3K-PKB信号传导通路障碍及脂联素的分泌有关[13]。这与本研究的模型建立及研究思路相符合。

胰岛素抵抗（IR）属中医的“消渴”，肾气虚是其发病之本，津涸液燥为发病之标。目前临床针对心衰时胰岛素抵抗的治疗，现代医学并没有统一的治疗原则，多用常规抗心衰药物联合胰岛素增敏剂，但两类药物合用时常相互拮抗，临床应用存在一定的局限性，而中医药较西医治疗心衰时胰岛素抵抗具有全方位、多途径的优势且成效显著[14]。因此本研究选用补肾益气方改善充血性心力衰竭胰岛素抵抗。补肾益气方药由淫羊藿、黄芪、人参、麦冬、五味子组成。方中黄芪、人参益气养心，淫羊藿温阳补肾，为君药，麦冬、五味子养阴生津，为臣药，诸药合用共奏补肾益气、滋阴生津的功效。研究发现黄芪多糖小檗碱（APBBR）可能通过下调IR-INS-1细胞miR-126-3p的表达从而增加IRS1 mRNA水平及其蛋白的表达，改善胰岛素抵抗[15]；人参皂苷可激活胰岛素信号通路，上调PI3K表达，有效促进PI3K信号转导下游的葡萄糖摄取和转运，逆转胰岛素抵抗[16]；淫羊藿总黄酮（TFE）能增加胰岛素敏感性，明显改善胰岛素抵抗相关因子的表达[17]；麦冬提取物可通过下调miRNA-29a，上调FOXO3表达明显改善胰岛素抵抗[18]；五味子油对2型糖尿病大鼠有降低血糖，调节血脂代谢紊乱，改善胰岛素抵抗的作用[19]

综上所述，补肾益气方可有效改善充血性心力衰竭大鼠的胰岛素抵抗，增加胰岛素抵抗过程中PKB、脂联素蛋白表达，保护心肌细胞，改善心功能。磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）/蛋白激酶B（PKB）信号转导通路出现障碍及细胞因子分泌失衡可能是心衰时胰岛素抵抗的重要分子机制，中医药在改善心力衰竭胰岛素抵抗的分子机制中具有多途径的作用，但本研究的中药复方成分复杂，研究存在一定的局限性，因此中医药改善心衰时胰岛素抵抗的分子机制仍需进一步研究。