代谢及炎症反应相关的巨噬细胞极化调控的研究进展

柳笑彦，刘 力 （中国医学科学院基础医学研究所病原学系，北京100005）

0 引言

慢性低度炎症与肥胖、2型糖尿病等代谢性疾病息息相关。代谢和免疫之间的相互作用在该类疾病的发生发展中起着举足轻重的作用［1］。在这些代谢性疾病的炎症反应部位均可以观察到巨噬细胞等免疫细胞的浸润。免疫细胞的炎性浸润可形成一种慢性低度炎症状态，进而加剧疾病进程［2-3］。

巨噬细胞是具有吞噬作用的固有免疫细胞，是机体抵御外界病原体的第一道防线。巨噬细胞是单核吞噬细胞系统的重要组成部分，可以吞噬并消化细胞碎片、异物、癌细胞和微生物［4］。巨噬细胞起源于单核细胞，单核细胞从骨髓释放进入血液循环或迁移到肝脏、肺泡、脾等组织，在这些部位形成成熟的巨噬细胞。因此，巨噬细胞无处不在，基本存在于所有组织中。例如，迁移到肝脏的巨噬细胞被称为“枯否细胞”，分散在表皮中的巨噬细胞则被称为“朗格汉斯细胞”，此外还有肺泡巨噬细胞、脂肪组织巨噬细胞等［5］。在机体防御、组织发育和维持机体动态平衡方面，巨噬细胞发挥着重要作用。在宿主防御病原感染和宿主的炎症反应中，巨噬细胞更是功不可没。由于巨噬细胞能在组织中存活长达数月而成为慢性炎症性疾病的关键参与者［6］。巨噬细胞在炎症反应阶段的主要作用是产生启动先天免疫反应的炎症细胞因子（如IL-1、IL-6和TNF-α）；在清除炎症反应阶段，巨噬细胞则下调炎症介质的生成，使抗炎细胞因子（如TGF-β和IL-10）释放增加。巨噬细胞能适应和应对各种微环境刺激，这是由于巨噬细胞具有可塑性和异质性的基础特点，因此可以适应和应对各种微环境刺激。例如，当微环境中存在促炎细胞因子IFN-γ、IL-1β或LPS等时，巨噬细胞能被经典激活，极化形成M1型巨噬细胞；而当微环境中存在IL-4、IL-10或IL-13时，巨噬细胞则被选择性激活，极化形成M2型巨噬细胞。M1型巨噬细胞在炎症反应的启始起动阶段起关键作用，能加重组织损伤；M2型巨噬细胞则对炎症的消除和组织修复至关重要［4，7］。M1型巨噬细胞的标志是释放大量炎性细胞因子、Th1趋化因子和ROS／NOS产物；而M2型巨噬细胞的标志是产生大量的抗炎细胞因子、Th2趋化因子、C-型凝集素、清道夫受体和多胺［8］。因此，为了防止宿主组织损伤，必须严格控制M1型巨噬细胞的激活；而人为地使巨噬细胞向M2型方向极化，则可达到对炎症反应进行干预的效果。研究［4］表明，巨噬细胞极化及其功能上的可塑性和异质性是疾病发展和转归的关键因素，而巨噬细胞极化与不同信号通路的选择性基因表达的调控有关。因此，揭示巨噬细胞极化相关的信号通路的调控机制对发展以巨噬细胞极化为中心的治疗策略具有十分重要的意义。

1 M1型巨噬细胞极化相关信号通路

1.1 TLR4相关信号通路Zhou等［9］的研究表明，姜黄素通过抑制 Toll样受体4（Toll-like receptor 4，TLR4）的表达及其信号通路来调节巨噬细胞极化。姜黄素可通过抑制TLR4的过表达来削弱LPS介导的炎症反应，与此同时，也可抑制MAPK信号转导通路的磷酸化和NF-κB（p65）的核转位，并以剂量依赖性的方式抑制M1型巨噬细胞的比例，从而诱导M1型巨噬细胞向M2表型极化。由此得出向M1型巨噬细胞极化的两条相关信号通路：TLR4-MAPK通路和TLR4-NF-κB 通路。

TLR4受体是由TLR4基因编码的分子量为95 kDa的Toll样受体家族成员，是重要的模式识别受体（pattern recognition receptor， PRR），在固有免疫反应及炎症的调控过程中发挥关键作用（图1）。TLR4可以识别病原相关分子模式（pathogen associated molecular patterns， PAMPs），包括 LPS、病毒蛋白、多糖和热休克蛋白等。TLR4复合体与募集的细胞内和细胞外适配器分子（如LPS）结合，引起细胞内激酶信号级联反应，如激活NF-κB信号转导通路和MAPK通路，最终导致巨噬细胞向M1型极化和TNF-α、IL-6和IL-12等炎性细胞因子的表达［10］。丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase， MAPK）是位于TLR4下游的特定于丝氨酸和苏氨酸的蛋白激酶，能针对各种刺激直接参与细胞反应，具有包括调节炎症反应在内的多种细胞功能［11］。MAPK只存在于真核生物中，包括3个常见的激酶亚家族：细胞外调节蛋白激酶（ERK）、应激活化蛋白激酶（又称c-Jun氨基末端激酶，JNK）和p38丝裂原活化蛋白激酶（p38 MAPK）。MAPK信号通路包括MAPKK激酶（MAPKKK）、MAPK激酶（MAPKK）和 MAP 激酶（MAPK）三级激酶核心反应——MAPKK激酶激活MAPK激酶，进一步激活MAPK。这些激酶调节多种底物的磷酸化和泛素化，最终导致免疫调节因子的表达。静息型巨噬细胞可以经脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）或Notch通路刺激极化成促炎症反应的M1型巨噬细胞，也可以IL4／IL4R相关通路极化成抗炎型的M2型巨噬细胞。某些药物或细胞因子可以经JAK2依赖或非依赖途径激活信号转导及转录激活因子3（signal transduction and activator of transcription 3，STAT3）使巨噬细胞向M2型极化（图1）。

图1 巨噬细胞极化相关信号通路

NF-κB（nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells）几乎存在于所有动物细胞中，控制DNA转录和细胞因子生成的蛋白质复合体。NF-κB可针对各种刺激参与细胞反应。静息状态下细胞内存在一定水平的NF-κB，因此不需要合成新蛋白质就能被激活，是一种快速反应转录因子。NF-κB信号转导通路是巨噬细胞免疫应答的关键介质［12］。哺乳动物 NF-κB家族由 5种蛋白组成，分别是NF-κB1蛋白（p105 → p50）、NF-κB2 蛋白（p100 →p52）、RelA 蛋白（p65）、RelB 蛋白和 c-Rel蛋白。 其中，RelA、RelB和c-Rel在羧基C端有一个反式激活结构域（transactivation domain）；NF-κB1 和 NF-κB2则是由各自的p105和p100前体蛋白通过泛素／蛋白酶体降解途径，将它们含锚定蛋白重复序列的C端选择性降解，形成成熟的 p50和p52。由于 p50和p52的C-末端均不包含反式激活区域，因而p50-p52同源二聚体不仅不能激活转录，还是κB位点的转录抑制因子。虽然有不同的C-末端，NF-κB家族的所有蛋白共享氨基N末端，均含有一个共同的核定位序列（nuclear localization sequence， NLS）的 Rel同源区域（rel homology domain）［13］。 在细胞质中处于静息状态的NF-κB复合物常为未激活的异源三聚体形式，这是由于 κB 抑制剂（Inhibitors of κB， IκBs）通过锚蛋白重复序列结构域覆盖NF-κB蛋白的NLS位点，使NF-κB在细胞质中处于静息状态（图1）。常见的NF-κB 复合物是由 p50、p65和抑制蛋白 IκBα构成的。IκB激酶（IKK）介导的 IκB磷酸化和随后的蛋白酶体降解，使p50-p65复合体释放进入细胞核，诱导相关促炎细胞因子和靶基因转录［14］。

综上所述，TLR4-MAPK和 TLR4-NF-κB信号通路的作用机制是TLR4受体复合物识别LPS刺激后可激活。①NF-κB通路，即激活髓样分化初级应答基因（myeloid differentiation primary response gene 88，MyD88），导致IKK介导的IκB磷酸化和随后的蛋白酶体降解，使p50-p65复合体释放进入细胞核，开启相关靶基因转录，促使巨噬细胞向 M1型极化；②MAPK级联反应的激活：MAPKKK和MAPKK依次激活，导致 MAPK（ERK、JNK和 p38）的激活（磷酸化），将信号传至细胞核，开启促炎细胞因子和M1型巨噬细胞相关基因的转录［9］（图1）。

也有研究［15］表明，胚芽乳杆菌CLP-0611在三硝基苯磺酸（TNBS）诱导的结肠炎小鼠通过阻断白细胞介素-1受体相关激酶 1（IRAK1）、转录因子 p65、ERK、JNK和p38的磷酸化而抑制LPS介导的TLR4信号通路，使M1型巨噬细胞向M2型极化。还有研究［16］表明，短乳杆菌G-101可以显著抑制由 TNBS引起的 IRAK1 的磷酸化和 NF-κB、MAPKs、Akt的激活，通过抑制 TLR4／NF-κB／MAPK／Akt信号通路，诱导M1型巨噬细胞向M2型极化，减轻炎症，改善结肠炎。

1.2 p38 MAPK通路p38 MAPK是可以被炎症细胞因子、LPS和生长因子等激活的一类丝裂原活化蛋白激酶，是酵母Hog1p在哺乳动物的同源基因。p38 MAPK的激活始于其应对刺激时的磷酸化。激活后，p38 MAPK将细胞外信号传导至细胞核，启动相关基因的转录。Yang等［17］的研究表明，M2型髓源性抑制细胞能通过LPS介导的p38 MAPK通路转化为M1型，但具体通路尚未知。Sung等［18］的研究表明，原花青素C1也可以通过p38 MAPK通路诱导巨噬细胞向M1型极化，然而，需要进一步的研究阐明哪些上游信号介质参与了这一通路。也有研究［19］表明，孟鲁斯特（一种抗过敏药，平喘药）可能通过抑制p38 MAPK和NF-κB通路而抑制哮喘M2型巨噬细胞极化，缓解哮喘。最近的一项研究［20］表明，Myc蛋白结合蛋白2通过抑制p38 MAPK信号通路而抑制IL-10触发的M2型巨噬细胞极化，p38 MAPK通路介导的抑制作用可能与上游激酶——MAPKKK12的泛素降解有关。上述研究都表明，p38 MAPK信号通路能启动相关靶基因的转录，促使巨噬细胞向M1型极化。

1.3 DLL4／Notch 信号通路Pagie 等［26］发现，由Notch 受体的配体 Delta样4（Delta-like 4，DLL4）触发的Notch信号通路，能促使巨噬细胞向M1型极化，并抑制其向M2型方向的极化。Notch信号通路在许多类型的细胞的多个细胞过程中发挥重要作用，决定细胞命运［21］。在哺乳动物中，Notch蛋白有4个受体（Notch1、Notch2、Notch3 和 Notch4） 和 5 个配体（Jag1、Jag2、DLL1、DLL3 和 DLL4）。 Notch 的经典激活通路是Notch蛋白的胞内区（notch intracellular domain，NICD）经剪切释放入细胞核，核 NICD结合RBP-J DNA结合蛋白，通过募集激活共同体蛋白形成转录激活体，最终促进M1型巨噬细胞相关基因的表达和相关细胞因子的产生［22-23］。Notch通路的经典激活有助于巨噬细胞向 M1型极化［24-25］。配体DDL4选择性上调基因表达，影响Notch基因的模式、活动和相关的转录，从而抑制巨噬细胞向M2型极化。研究发现，DDL4／Notch通路和IL-4／IL-4R通路的相互作用抑制巨噬细胞向M2型的极化。即Notch蛋白的受体Notch 1和它的配体DDL4相互作用，抑制IL-4诱导的M2型巨噬细胞标志物上调，抑制巨噬细胞向M2型极化。其中，对M2型极化的抑制是DLL4／Notch1／HES1信号通路，在 STAT水平对 IL-4／IL-4R信号通路进行干预造成的［26］。经典的IL-4信号通路是JAK1通过酪氨酸磷酸化STAT3和STAT6，磷酸化的STAT二聚体进入细胞核启动相关靶基因的转录，促使巨噬细胞向M2型极化。而对JAK／STAT通路的抑制，显著增强DLL4对M2型局势细胞极化的抑制效应（图1）。

2 M2型巨噬细胞极化相关信号通路

2.1 p38 MAPK相关信号通路一般我们认为IL-4诱导巨噬细胞向M2型极化主要是由于IL-4和其受体结合激活了STAT-6和胞内磷脂酰肌醇激酶（phosphoinositide 3-kinases，PI3K）两个信号通路，即IL-4和I型受体 IL-4R（主要表达 IL-4Rα和 IL-4Rγ）结合，激活了JAK家族的蛋白酪氨酸激酶JAK-1和JAK-3：①直接导致了STAT-6的磷酸化，STAT-6随后易位至细胞核内，与靶基因启动子的特定区域结合在一起，激活STAT-6信号通路；②JAK家族的蛋白酪氨酸激酶被激活后，募集了胰岛素受体底物IRS-1／2，IRS-1／2被磷酸化，进而激活PI3K和其下游激酶Akt（蛋白激酶B）。这两个信号通路均导致巨噬细胞向M2型极化（图1）。

研究［27］表明，细胞因子IL-4可诱导巨噬细胞M2型极化，除了引起上述两个信号通路（STAT-6和PI3K）激活之外，还引起了p38丝裂原活化蛋白激酶（p38 MAPK）的磷酸化。IL-4结合到白细胞介素-4受体（IL-4R）上，引起JAK家族蛋白酪氨酸激酶激活后，导致p38 MAPK磷酸化，而p38 MAPK的磷酸化又分别激活了STAT-6和PI3K-Akt两个信号转导通路，最终导致M2型巨噬细胞生物标志物表达上调。

也有研究［28］表明，人载脂蛋白 E（ApoE）通过人载脂蛋白E受体2（apoER2）诱发的p38 MAPK酪氨酸激酶依赖性激活，能促进巨噬细胞从M1型向M2型极化，但其具体信号通路尚待研究。

2.2 STAT3信号通路STAT3是STAT蛋白家族的重要成员。当存在细胞因子和生长因子刺激时，配体和受体结合，引起受体二聚化并激活 JAK激酶。STAT3作为转录因子，能被JAK激酶磷酸化，形成同源或异源的二聚体。随后STAT3二聚体转运进入细胞核，激活相关基因的转录（图1）。

Qin等［29］发现，芬戈莫德（FTY720）能通过STAT3信号通路使小胶质细胞（相当于脑和脊髓中的巨噬细胞）向M2型极化而防止缺血性脑白质损伤。FTY720能增加STAT3的mRNA水平，并使体内外的STAT3总蛋白表达和磷酸化水平升高，明显激活STAT3通路。Wang等［30］发现，肠促胰岛素类药物（exendin-4，Ex-4）能通过 cAMP-PKA-STAT3信号通路，诱导骨髓来源的巨噬细胞向M2型极化。Ex-4激活胰高血糖素样肽-1（GLP-1）受体，导致细胞内cAMP的水平变化，激活PKA，并使STAT3磷酸化。磷酸化的STAT3二聚体转运进入细胞核，引起M2型巨噬细胞相关基因的表达。Yuan等［31］发现，香烟烟雾提取物（cigarette smoke extract，CSE）能通过JAK2-STAT3信号通路诱导小鼠巨噬细胞向M2型极化。巨噬细胞Ana-1经CSE处理后，可观察到JAK2和STAT3的磷酸化，且其磷酸化水平显著高于未经处理的细胞。JAK2-STAT3通路的抑制剂WP1066则阻断巨噬细胞向M2型极化。但这一通路的完整机制尚待研究。还有研究［32］表明，当IL-4存在时，促红细胞生成素（erythropoietin，EPO）在体内外能通过JAK2／STAT3／STAT6信号通路促使巨噬细胞向M2型极化，防止横纹肌溶解导致的急性肾损伤。研究发现，这一信号通路可能存在的机制如下：当IL-4存在时，EPO激活JAK2，导致STAT3和STAT6的磷酸化并形成二聚体，二聚体转运进入细胞核，启动M2型巨噬细胞相关基因的转录。上述机制（具体信号通路）均有待进一步研究完善。

3 中药及生物材料对巨噬细胞极化的影响

前文中我们提到，姜黄素通过抑制TLR4-MAPK／NF-κB信号转导通路剂量依赖性地抑制M1型巨噬细胞，并诱导M1型巨噬细胞向M2表型极化［9］。Liu等［33］的研究表明，在肿瘤微环境中，猪苓多糖通过识别TLR4受体导致 NF-κB通路的激活，从而促使Raw264.7巨噬细胞向M1表型极化，并促进促炎细胞因子的分泌。Xu等［34］的研究表明，安石榴甙通过激活Akt和STAT3信号通路促进HO-1的过表达，诱导小鼠巨噬细胞向M2c表型极化。Jia等［35］的研究表明，巨噬细胞中仅有M1表型时，天麻素通过上调BCL6的表达诱导向M2表型的极化。

纳米（nanparticle）是一种新型的生物材料，在免疫调控、疾病治疗及诊断检测等诸多生命科技领域发挥着越来越重要的作用。纳米作为一个外来物在体内可以对巨噬细胞起到调控作用［36］。可以用金、银等贵金属来修饰纳米分子，比如纳米金可以比纳米银诱导出更强的M1巨噬细胞极化反应，这是由于纳米金除如纳米银一样可经胞饮途径进入巨噬细胞外，还可以通过受体介导的内吞途径进入巨噬细胞［36］。此外，对纳米分子的表面进行修饰也可以达到调控巨噬细胞极化的目的。将不同的生物活性多肽RGD或GLF经PEG粘附于金纳米棒表面可对巨噬细胞的极化产生不同的影响：GLF修饰的纳米棒可促进巨噬细胞向M1型极化，而RGD修饰的金纳米棒则有促进巨噬细胞向M2型极化的作用［36］。

综上所述，炎症和免疫细胞在人体各系统疾病的发生、发展和终止中扮演着不可或缺的角色。特别是巨噬细胞，其表型能够根据所处环境中的不同信号发生动态变化，导致人体相关脏器功能发展和修复。这一特点使巨噬细胞成为炎性反应性疾病的潜在治疗靶点。我们对巨噬细胞激活的信号通路和相关转录因子还知之甚少，因此，加强对巨噬细胞极化相关信号通路的研究，找到操纵巨噬细胞功能表型切换的靶点，是治疗一系列炎性反应性疾病的重要依据。