小分子干扰RNA抑制黏着斑激酶基因对子宫内膜癌细胞生物学特征的影响

贾冬丽，方丽丽，司晓辉，王远菊

子宫内膜癌约占女性生殖系统恶性肿瘤的三分之一，且发病率呈上升趋势[1-2]，严重威胁女性健康。该病发生涉及多基因、多步骤、多信号通路。黏着斑激酶(focal adhesion kinase，FAK)作为非受体蛋白酪氨酸激酶超家族成员，参与调控细胞增殖、生长、分化过程[3-4]，近年来研究发现[5]，FAK在多种恶性肿瘤组织中表达升高，且参与了肿瘤浸润转移、增殖、凋亡过程。本研究利用小分子干扰RNA(small interference RNA，siRNA)技术下调FAK基因表达，观察对人子宫内膜癌细胞HEC-1A增殖、迁移和侵袭能力的影响。

1 资料与方法

本研究起止时间为2016年8月3日至2017年1月16日。

1.1主要试剂和设备人子宫内膜癌HEC-1A细胞购自中科院上海生命科学研究院，胎牛血清、DMEM/F12培养基、胰酶均购自美国Gibco公司，总RNA提取试剂盒(Trizol法)和Lipofectamine 2000转染试剂盒由美国Invitrogen公司提供，逆转录和PCR试剂盒均购自武汉凌飞生物有限公司，FAK及内参引物均由上海生工生物公司设计合成，FAK干扰序列(siRNA-FAK)、阴性对照序列均由上海吉玛制药技术有限公司设计合成，MTT液购自上海将来实业股份公司，Transwell小室购自美国Corning公司，RIPA裂解液购自碧云天生物公司，磷酸酶抑制剂购自美国Sigma公司，兔抗FAK多克隆抗体购自武汉博士德公司，兔抗Akt单克隆抗体购自美国CST公司，兔抗磷酸肌醇3激酶(PI3K)单克隆抗体、兔抗磷酸化(p)-Akt多克隆抗体均购自美国Santa Cruz公司，兔抗哺乳动物雷帕霉素(mTOR)靶蛋白、p-mTOR多克隆抗体购自美国Cell signaling公司，StepOnePlus实时荧光定量PCR仪购自美国ABI公司。

1.2方法

1.2.1细胞培养及处理 将细胞放于DMEM/F12培养基(含10%胎牛血清)中，培养于含5%CO2、37 ℃培养箱。细胞融合度>70%时，传代培养。取对数生长期细胞，按试剂盒说明对细胞分组转染：1siRNA-FAK组，转染FAK特异性siRNA序列正义链为5’-CGCGTCGTAATACTCGCTCCATTGCACCTTGATATCCGGGTGCAATGGAGCGAGTATTATTTTTT-CCAAC-3’，反义链为5’-GCGGTGGACCCGGTCATAATAAAGTTCTGCTATTATGACCGGGTCCACC-AAAAAACAGCTGTTCGA-3’；2siRNA-阴性对照组，转染siRNA-阴性对照序列正义链为5’-CGCGTCG-CCACTTACGATAGCTCCATTCTTGATATCCGGAAT-GGAGCTATCGTAAGTGGTTTTTTCCAAC-3’，反义链为5’-GATCCCCACCTGGGCCAGTATTATTTCAAGACGATAATACTGGCCCAGGTGGTTTTTTGTCGACA-3’；3空白对照组，不作任何处理。

1.2.2实时荧光定量PCR技术检测细胞中FAK基因表达 各转染后继续培养48 h，按照用Trizol法提取试剂盒说明提取总RNA，检测纯度。逆转录为模板单链cDNA，以cDNA为模板行PCR。引物序列：FAK上游为5’-TCCTAATGTTG ATGCCTGCC-3’，下游为5’-CCTTGAAAAGGCTTCACACC-3’；GAPDH上游为5’-TCCGGGTGATGCTTTTCCTAG-3’，下游为5’-TTTGCGGTGGAAATGTCCTTTTC-3’。反应条件：92 ℃ 1 min，92 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，75 ℃ 30 s。循环38次，均设平行复孔3个。FAK基因相对表达量计算采用2-△△Ct法[6]。

1.2.3MTT法检测细胞增殖能力 将各组细胞离心后，重悬细胞，于96孔板接种(密度5×104个/孔)，继续培养，于12 h、24 h、48 h、72 h、96 h时，向各孔加入MTT液(5 mg/mL)20 μL，孵育4 h，终止培养，小心的将孔内上清液吸弃，将150 μL二甲基亚砜加入各孔，振荡15 min，待结晶物完全溶解后，利用酶标仪检测各孔在570 nm波长处的吸光度A值。重复实验6次[7-8]。

1.2.4Transwell法检测细胞迁移能力 各组细胞转染后培养48 h，离心，留沉淀，用无血清培养基重悬，加入到Transwell小室上室(密度为1×105个/孔)，下室加入含有15%胎牛血清的培养基，恒温培养24 h，取出小室，将散落的细胞去除，PBS冲洗3次，固定，结晶紫染色，用倒置显微镜观察，随机取5个视野对细胞计数，每组细胞设置3个平行复孔，重复实验6次[9]。

1.2.5Transwell法检测细胞侵袭能力 将 Martrigel基质胶稀释后铺于小室上室，过夜风干。其余步骤同1.2.4。

1.2.6蛋白质印迹法(Western blot)检测细胞中FAK、PI3K、p-Akt、p-mTOR蛋白表达 各组细胞转染后培养48 h，用预冷的RIPA裂解液和磷酸酶抑制剂分别提取总蛋白并检测纯度。取总蛋白30 μL，进行10%聚丙烯胺凝胶电泳，电至PVDF膜上，用3%牛血清白蛋白室温下封闭60 min，TBST冲洗3次，加入一抗FAK、PI3K、p-Akt、p-mTOR(稀释比例1∶1 000、1∶800、1∶1 200、1∶500)，4 ℃过夜孵育，TBST冲洗3次，将二抗加入，37 ℃孵育60 min，用TBST冲洗3次，暗室下用ECL反应15 min，用Image J软件分析，计算细胞中FAK、PI3K、p-Akt、p-mTOR蛋白表达量[10]。

表1 各组细胞增殖能力(A值)比较/±s

注：与空白对照组比较，aP<0.05；与siRNA-阴性对照组比较，bP<0.05

2 结果

2.1FAK基因在各组细胞中表达FAK mRNA在siRNA-FAK组细胞中相对表达量为(1.31±0.15)，显著低于siRNA-阴性对照组和空白对照组，分别为(2.06±0.18)和(2.11±0.20)，差异有统计学意义(F=53.294，P<0.001)。

2.2细胞增殖能力siRNA-FAK组、siRNA-阴性对照组和空白对照组12 h时细胞吸光度A值差异无统计学意义(P=0.626)。siRNA-FAK组、siRNA-阴性对照组和空白对照组24 h、48 h、72 h和96 h时细胞吸光度A值均差异有统计学意义(P<0.005)；与siRNA-阴性对照组和空白对照组比较，siRNA-FAK组24 h、48 h、72 h、96 h时细胞吸光度A值均降低，均差异有统计学意义(P<0.05)。详见表1和图1。

图1 各组细胞增殖能力比较

组别平行复孔数迁移细胞数侵袭细胞数空白对照组3123.6±15.4140.2±14.3siRNA-阴性对照组3119.5±14.8137.8±13.5siRNA-FAK组379.6±11.7ab91.5±10.6abF值20.31219.517P值<0.001<0.001

注：与空白对照组比较，aP<0.05；与siRNA-阴性对照组比较，bP<0.05

2.3细胞迁移和侵袭能力siRNA-FAK组、siRNA-阴性对照组和空白对照组迁移细胞数和侵袭细胞数均差异有统计学意义(P<0.001)；与siRNA-阴性对照组和空白对照组比较，siRNA-FAK组迁移细胞数和侵袭细胞数均减少，均差异有统计学意义(P<0.005)，详见表2、图2、图3。

2.4细胞中FAK、PI3K、p-Akt、p-mTOR蛋白表达siRNA-FAK组、siRNA-阴性对照组和空白对照组FAK、PI3K、AKT、p-Akt、mTOR、p-mTOR蛋白相对表达量均差异有统计学意义(P<0.001)；siRNA-阴性对照组与空白对照组FAK、PI3K、AKT、p-Akt、mTOR、p-mTOR蛋白相对表达量均差异无统计学意义(P=0.694、0.262、0.623、0.541、0.645、0.731)；与siRNA-阴性对照组和空白对照组比较，siRNA-FAK组细胞中FAK、PI3K、p-Akt、p-mTOR蛋白表达相对表达量均降低(P<0.005)，而Akt和mTOR蛋白相对表达量均升高(P<0.005)，详见表3和图4。

表3 各组细胞中FAK、PI3K、p-Akt、p-mTOR蛋白表达比较/±s

注：与空白对照组比较，aP<0.05；与siRNA-阴性对照组比较，bP<0.05

图4 各组细胞中FAK、PI3K、p-Akt、p-mTOR蛋白表达

3 讨论

子宫内膜癌好发于绝经后女性，但近年来出现年轻化趋势[11]，虽然现在子宫内膜癌病人生存时间得到延长，但其高复发率、高病死率仍严重威胁病人预后[12-13]。研究表明[14]，肿瘤发生、进展、转移、侵袭涉及诸多基因、步骤和通路。FAK作为一种广泛存在于细胞质内的非受体蛋白酪氨酸激酶，是整合素信号家族中重要的信号因子[15]，与多种细胞生物学过程中发挥重要作用[16]。研究表明[17]，FAK高表达于多种恶性肿瘤组织中，参与了肿瘤发生、进展、侵袭过程。Zhou等[18]指出，FAK在子宫内膜癌组织中呈高表达，且与病人总生存期降低显著相关。本研究结果显示，siRNA-FAK组细胞中FAK mRNA和蛋白相对表达量均降低，提示利用siRNA技术可成功将HEC-1A细胞中FAK基因表达抑制。

MTT实验结果显示，与siRNA-阴性对照组和空白对照组比较，siRNA-FAK组24 h、48 h、72 h、96 h时细胞吸光度A值降低，说明沉默FAK基因细胞增殖活力被抑制，提示该基因与细胞增殖过程密切相关。本研究显示，与siRNA-阴性对照组和空白对照组比较，siRNA-FAK组迁移细胞数和侵袭细胞数减少，说明在沉默FAK基因表达后细胞迁移和侵袭能力被抑制，提示该基因可能与细胞迁移和侵袭过程关系密切[19]。PI3K/Akt/mTOR作为与肿瘤增殖、侵袭转染密切相关的信号通路，在多种恶性肿瘤组织中表达异常[20]，有研究指出[21]，PI3K/Akt/mTOR信号通路异常活化可抑制肿瘤细胞凋亡，促进细胞增殖，加快细胞侵袭、转移过程。本研究显示，在抑制FAK基因表达后，siRNA-FAK组细胞中PI3K、p-Akt、p-mTOR蛋白表达相对表达量均降低，说明特异性抑制HEC-1A细胞中FAK基因可显著抑制PI3K/Akt/mTOR信号活化，提示FAK基因可能通过PI3K/Akt/mTOR信号而参与子宫内膜癌细胞增殖、迁移及侵袭过程。

综上所述，沉默FAK基因可减少HEC-1A细胞增殖，抑制细胞迁移及侵袭，其机制可能与抑制PI3K/Akt/mTOR信号有关，有望为子宫内膜癌基因治疗提供潜在的靶位。

(本文图2，3见插图1-2)