液相色谱法测定筋骨草胶囊特征图谱研究

聂万松，汪艳，占晓敏，王云龙，窦玮，汪波

筋骨草胶囊为筋骨草(白毛夏枯草)经加工制成的胶囊剂，具有清热解毒，止咳，祛痰，平喘。用于急、慢性支气管炎、肺脓疡[1 ]。原标准未对特征图谱进行检测。为提高本品的质量标准，本论文通过研究建立其特征图谱，对产品进行质量控制。本法专属性强，结果准确，操作简便，可作为本药的质量控制方法之一。

1 仪器与试药

高效液相色谱仪(Agilent 1260)，电子分析天平(岛津AUW120D十万分之一)；木犀草素(111520-201605，中国食品药品检定研究院)；乙腈、甲醇为色谱纯，赛默飞世尔科技(中国)有限公司生产；乙醇为色谱纯，西陇化工股份有限公司生产；水为超纯水，其余试剂均为分析纯。筋骨草胶囊(黄山市天目药业有限公司，生产批号161001、170301、170302、170303)。

2 方法与结果

本研究起止时间为2016年2月至2017年5月。

2.1色谱条件色谱柱：Kromasil 100-5C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：乙腈为流动相A，0.4%磷酸溶液为流动相B，按表1进行梯度洗脱；流速：1 mL·min-1；检测波长为350 nm；柱温30 ℃；进样量：10 μL。理论板数按木犀草素峰计算应不低于5 000，其余分离度应符合规定。

表1 流动相梯度洗脱

2.2溶液的制备

2.2.1对照品溶液的制备 取木犀草素对照品用乙醇配制成1 mL含40 μg的溶液，即得。

2.2.2供试品溶液的制备 取装量差异项下的本品内容物，研细，取约1 g，精密称定，置锥形瓶中，加入乙醇25 mL，精密称定重量，加热回流30 min，放冷，称重，用乙醇补足减失的重量，摇匀，过滤，取续滤液，即得。

2.2.3阴性供试品溶液制备 按筋骨草胶囊成品制剂方法制得缺筋骨草的阴性样品，按供试品溶液制备方法制得阴性供试品溶液。

2.3专属性试验分别用“2.2.1”“2.2.2”“2.2.3”节的溶液进样，按“2.1”节色谱条件进行测定，记录色谱图的出峰时间，结果见图1～4。

木犀草素对照品峰(图1)与筋骨草胶囊中木犀草素峰(图2)的保留时间一致。供试品特征图谱(图2)中有多个峰出现，选取基线分离清晰的峰为特征峰：木犀草素对照品峰(峰1)、随后出现了2个较为明显的特征峰(峰2、峰3)。选定：在供试品特征图谱中的3个特征峰中(图4)，与木犀草素参照物峰相对应的峰设置为峰1(S)，计算峰2、3与S峰的相对保留时间。结果：峰2～3与峰1(S)的相对保留时间为1.218(峰2)、1.794(峰3)。见表2。

图1 木犀草素对照品溶液高效液相色谱图

图2 筋骨草胶囊供试品溶液高效液相色谱图

图3 缺筋骨草阴性供试品溶液高效液相色谱图

注：峰1(S)：木犀草素图4 对照特征图谱

组别木犀草素峰位置/min其他峰位置/min特征图谱比值阴性样品无无木犀草素对照品溶液14无筋骨草胶囊16100114.27417.395、25.6121.218、1.794

阴性样品溶液在相应位置处无相应的峰出现，对木犀草素等3个峰无干扰，见图3。

初步定为：峰2～3与峰1(S)的相对保留时间为：1.218(峰2)、1.794(峰3)。

2.4重复性试验分别称取筋骨草胶囊(批号：161001)样品按“2.2.2”节方法制备6份供试品溶液，按上述色谱条件重复进样6次，在供试品特征图谱(见图2)中选定的3个特征峰中，与木犀草素参照物峰相对应的峰1(S)，计算峰2、3与S峰的相对保留时间，结果峰2～3与峰1(S)的相对保留时间为：1.217(峰2)、1.79(峰3)，其相对保留时间在规定值[1.218(峰2)、1.794(峰3)]的±5%之内，表明此特征图谱测定方法重现性良好。见表3。

表3 重复性试验情况

2.5稳定性试验取筋骨草胶囊(批号：161001)按供试品溶液的制备方法制备，按上述色谱条件于0、2、4、8、12、15、19、24h进样测定相对保留时间，RSD=0%，与标准相对保留时间相比，相差少于±5%。结果表明样品溶液在24h内特征图谱稳定。相对保留时间见表4。

表4 稳定性试验情况

2.6筋骨草胶囊样品测定取筋骨草胶囊按供试品溶液的制备方法制备，按“2.1”节色谱条件进行测定，测定各峰保留时间。结果：各批号产品特征图谱相对保留时间平均为：1.220(峰2)、1.801(峰3)在规定值[1.218(峰2)、1.794(峰3)]的±5%之内。见表5。

表5 特征图谱测定结果表

2.7耐用性

2.7.1不同色谱柱 本实验分别使用了Kromasil100-5C18柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)及Welch xtimateC18(4.6 mm×250 mm，5 μm)两种不同的色谱柱，并分别在安捷伦1260型高效液相色谱仪及Thermo高效液相色谱仪上测定，结果无明显差异。使用Kromasil100-5C18柱测定结果见表6，使用Welch xtimateC18柱测定结果表明：不同色谱柱影响不大。见表7。

2.7.2柱温 经分别按柱温25 ℃、30 ℃方法对样品进行测定，对其液相色谱图及数据进行比较，结果表明柱温对相对保留时间的影响：SD为0.028%(<2%)，在合格要求内。见表8。

3 讨论

3.1实验色谱条件选择[2-7]，木犀草素对照品溶液经光谱扫描，在350 nm波长处有最大吸收，故选定350 nm为检测波长;流动相曾采用乙腈-0.4%磷酸溶液、乙腈-0.02 mol/L磷酸二氢钾溶液等不同的系统，尝试了不同的流动相比例，结果以本文采用的乙腈-0.4%磷酸溶液梯度洗脱，分离效果好。供试品溶液的制备[2-7]，比较了超声处理和回流提取，提取时间以及提取溶剂，最后确定本文方法提取供试品完全，且分离效果好。

表6 Kromasil100-5C18柱特征图谱测定结果

表7 Welch xtimateC18柱特征图谱测定结果

表8 柱温对相对保留时间的影响

3.2参照药典及不同文献测定筋骨草胶囊乙酰哈巴苷含量[8-10 ]，但因产品生产工艺原因，乙酰哈巴苷转移率较低，不符合要求。

3.3筋骨草胶囊的特征图谱具有鉴别不同种的筋骨草的作用经多次测定，筋骨草胶囊与筋骨草的特征图谱具有一致性。我公司2017年1月份同时分别从四川、浙江及湖北采购来的均称为筋骨草药材，经检定四川产的“筋骨草”为散瘀草(Ajuga pantantha Hand.-Mazz)，浙江及湖北的“筋骨草”为正品筋骨草(Ajuga decumbens Thunb.)，散瘀草与筋骨草两者从外观区分极为相似，且按药典检测均含有乙酰哈巴苷。但从特征图谱进行比较，能正确判断筋骨草正品与伪品的区别。

4 结论

筋骨草胶囊在液相色谱图中，供试品图谱3个特征峰，对其进行相对保留时间检测，快捷、简便、准确。