淋巴细胞免疫治疗应用于反复种植失败的机制探讨

谭艳 杨章莉

胚胎的成功种植，依赖于胚胎质量、子宫内膜容受性和免疫因子等多方面的因素。具有良好发育潜能的胚胎被放入宫腔后，着床位点产生的免疫反应介导胚胎的入侵，同时母体产生的免疫耐受又保证了胚胎这个半同种异体抗原不被排斥，而继续维持妊娠。但是不适当的免疫调节会导致多种生殖障碍，如反复种植失败、复发性流产等。胚胎移植3次及以上或者移植10个及以上的质量良好胚胎均未能妊娠，被称为反复种植失败(repeated implantation failure，RIF)，这是体外受精-胚胎移植过程中的棘手问题。近年来，采用淋巴细胞免疫治疗来提高RIF患者的妊娠结局，正日益受到关注，下面对其可能的免疫学机制做一综述。

一、植入和妊娠早期的免疫过程

现代生殖免疫学证明，胎儿-母体界面的免疫变化和周围免疫反应参与诱导母体耐受反应，在某些生殖障碍的情况下，免疫细胞的功能和/或数量发生了改变[1]。调节T细胞(Treg)、自然杀伤细胞(NK)、巨噬细胞和辅助T细胞(Th)中的Th1、Th2、Th17是调节母体耐受和防止胎儿排斥的主要免疫细胞[2]。巨噬细胞和子宫特异性自然杀伤细胞(uNK)是蜕膜期的主要白细胞，在月经前期，子宫内膜的主要白细胞为炎性细胞，如中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和巨噬细胞。接下来，将巨噬细胞、Th1/Th2平衡、Th17/Treg平衡、炎症因子和趋化因子在维持妊娠中的作用，做简要概述。

1.巨噬细胞：巨噬细胞包含20%的子宫内膜白细胞，存在于子宫内膜增殖、分化和脱落期。这些细胞通过产生生长因子、细胞因子和蛋白酶来创造一个局部的微环境。在最初的子宫内膜剥脱迹象出现之前，炎性白细胞进入子宫内膜基质和局部分泌基质金属蛋白酶(MMPs)，开始细胞外基质分解并触发炎症级联反应，最终导致子宫内膜脱落。

2.Th1 / Th2平衡：妊娠期，免疫系统从Th1向Th2反应倾斜，有利于保护胎儿不受母体免疫系统的影响。Th1和Th2细胞是CD4+T细胞的主要亚群，它们在免疫反应中的独特功能，与其独特的细胞因子分泌模式有关。为了解释调控Th1/Th2平衡的可能机制，有人提出胎儿诱导Th0细胞(幼稚T细胞)选择Th2通路成熟，然后产生的Th2也有助于降低Th1的免疫反应[3]。

3.Th17 / Treg平衡：Th17细胞在排斥胚胎抗原中起着主要作用，因此不利于维持妊娠。母体对胎儿的耐受性完全取决于Treg和Th17细胞之间的精细平衡，如果平衡改变，会导致妊娠出现问题，如复发性流产[4]。

4.炎症因子和趋化因子：白细胞募集过程中，白细胞介素8(IL-8)、单核细胞趋化蛋白3、嗜酸细胞紫杉醇、巨噬细胞炎性蛋白1、巨噬细胞衍生趋化因子等人类子宫内膜的趋化因子，在不同的阶段具有动态表达水平[5]。趋化因子水平的异常改变可能导致不同白细胞的异常聚集，从而扰乱妊娠或月经。刘洋虹等[6]研究发现，RIF患者经宫腔灌注自体外周血单个核细胞(PBMCs)治疗后得到了较高的临床妊娠率(47.2%)；宫颈分泌物中的白细胞介素6(IL-6)，及其与肿瘤坏死因子α(TNF-α)的比值均显著升高(P<0.05)。禹果[7]认为PBMCs可以有效地提高子宫内膜容受性标志物白血病抑制因子(LIF)和整合素αVβ3的表达，上调子宫内膜容受性，有利于胚胎着床。

二、LIT诱导产生的免疫因子

保护妊娠的淋巴细胞免疫治疗(Lymphocyte immuntherapy，LIT)是将来自丈夫或无关第三者的外周血淋巴细胞注射入准妈妈体内，以准备免疫系统对胚胎抗原的耐受[8]。

据报道，大约81%的RIF患者存在子宫内膜异常情况，其中56.6%的患者有过度免疫反应，25%的患者有低免疫反应[9]。虽然RIF的基础机制尚未完全阐明，但有人提出以下假设来描述同种异体免疫的积极作用：细胞因子产生模式的改变，抗特殊型抗体(Ab2)的产生[10]、混合淋巴细胞反应封闭抗体的表达(MLR-BF)[11]，抗父细胞毒性抗体的产生(APCAs)[12]，以及孕激素诱导的阻断因子(PIBF)的表达[13]。LIT诱导产生APCAs、MLR-BF和Ab2，这些抗体可覆盖胎儿表面的父系HLA，从而防止母体NK细胞和T细胞的攻击。此外，LIT显著减少Th1和Th17，并增加Th2和Treg细胞水平，因此导致Th2和Treg产生的细胞因子增加，比如IL-10、IL-4HE和TGFβ，这些有助于成功妊娠，而减少Th1和Th17分泌的细胞因子，如INF-γ和TNF-α，这些因子不利于妊娠。总体来说，LIT调节了母亲的免疫系统以保护胎儿，使怀孕成功。

1.封闭抗体：封闭抗体(BAb)是成功妊娠的重要因素，通过抑制基质细胞毒性T细胞对胎儿起保护作用。BAb也可以阻止针对胎儿抗原产生的细胞介导免疫(CMI)。在正常妊娠期妇女中，在滋养细胞发育过程中会产生BAb，而在RIF患者的滋养细胞中，这一过程被破坏了。已发现父系淋巴细胞进行免疫治疗的患者可以促进BAbs的产生，诱导妊娠成功。Hua等的Meta分析结果显示，LIT之后BAb阳性患者的怀孕率明显高于BAb阴性患者(P<0.001)[14]。

2.混合淋巴细胞反应封闭抗体：研究表明，混合淋巴细胞反应封闭抗体(MLR-BF)阳性患者，其术后顺利怀孕的几率明显高于阴性患者。因此，是否存在MLR-BF可以作为免疫治疗的标准之一。另一方面，几乎所有的患者，MLR-BF都可以用其丈夫的淋巴细胞进行免疫治疗后被诱导产生。自然获得的MLR-BF可能是由于母系源性抗原导致的，也可能是由于接触了精液而导致的。Pandey等[11]的结果证实，对于复发性流产患者，接受父系淋巴细胞免疫的妇女，其MLR-BF水平显著高于接受自体或无关第三者淋巴细胞免疫的妇女。

3.Th-1和Th-2相关趋化因子受体的表达：LIT可能改变NK和T细胞的比例，或Th1和Th2相关趋化因子受体的表达，从而为胚胎植入提供合适的免疫环境[15]。已经证实，Th2产生的细胞因子，如IL-10和IL-4，有助于成功怀孕，而来自Th1的细胞因子，如干扰素-γ(IFN-γ)和TNF-α则产生不良的影响。此外，研究表明，在怀孕的前三个月，TNF-α的产生受到抑制，并且在妊娠8个月之前，TNF-α不会显著增加。Gharesi-Fard等[16]的发现强调了上述LIT机制，该研究认为，LIT导致了IFN和TNF的大量减少，LIT可能对治疗前TNF-α浓度高于400 pg/ml的患者有更有利的影响。因此，评估TNF-α是可以接受免疫治疗的患者的另一个标准。

在RIF患者中，Th1/Th2的不平衡导致了IL-2、IFN-γ和TNF-α的水平的增加，以及在外周血淋巴细胞中降低了IL-4和IL-10的水平。结果表明，这些患者PLI后细胞因子平衡向Th2活性转移，免疫细胞发生良好变化。RIF患者进行PLI可能引起TNF-α、IFN-γ、IL-4、IL-10的水平以及NK细胞活性的显著变化，这可提高怀孕成功率[17]。

4.CD30：活化型Th2表型可以分泌CD30，这是一种糖蛋白受体，是肿瘤坏死因子受体超家族的成员，其功能是调节Th1/Th2平衡。蛋白水解CD30胞外结构域的分裂产生可溶性的CD30(sCD30)。sCD30是Th2免疫反应的血清指数，在孕妇血清中显著增加。Gharesi-Fard等[18]报道sCD30浓度在LIT后显著增加，尽管这种增加与妊娠结局无关。因此，母亲血清中sCD30浓度可能不是评价LIT结果的良好标志，因为母亲的全身循环不一定反映母体胎儿界面的环境。

5.Treg细胞：不明原因复发性流产患者外周血淋巴细胞的CD4+CD25+Treg细胞水平低于未怀孕的健康妇女，这意味着这些细胞可能增加对孕妇对孕母抗原的免疫耐受，从而保护妊娠。据观察，使用父系单核细胞对不明原因复发性流产患者进行免疫治疗后，Th17和Treg细胞水平分别降低和增加[19]。Treg细胞通过抗炎细胞因子的分泌，如IL-10和TGF，来发挥它们的功能。

三、用于反复种植失败的患者

为了保证RIF患者的胚胎顺利植入，近些年采取了各种治疗措施，如给予粒细胞集落刺激因子(G-CSF)[20]、静脉注射免疫球蛋白和泼尼松[21]和他克莫司[22]。2006年，Yoshioka等[23]采用了一种新的方法，应用PBMCs来改善RIF患者的种植情况。PBMCs由任何具有圆形细胞核的外周血细胞组成，包括淋巴细胞(T细胞、B细胞、NK细胞)、单核细胞和一小部分树突细胞。考虑到淋巴细胞占PBMCs的绝大部分，使用PBMCs进行治疗相当于LIT。在该研究中，采卵当天收集PBMCs，在HCG的存在下培养48 h。然后，将从患者身上新获得的PBMCs与培养的PBMCs混合，注射入患者宫腔。该研究报告在PBMC治疗组的临床妊娠、植入和活产率高于未治疗组。考虑到促肾上腺皮质激素释放激素(CRH)在促进子宫内膜决定和母体-胎儿免疫调节中的重要作用，建议宫内给予CRH治疗的自体PBMC可以提高RIF患者的临床妊娠率[23]。2016年的研究也表明，与未处理的RIF组相比，新鲜胚胎移植前3 d宫内注射培养的自体PBMCs可以显著增加RIF患者的植入率和临床妊娠率(21.5%，44.4%比8.6%，14.81%)[24]。据报道，PBMCs治疗患者的植入率和临床妊娠率分别比RIF对照组高出25%和12%[25]。Li等[26]对294例进行冷冻/解冻胚胎移植周期的RIF患者进行了为期1 d的培养，并与339例RIF患者进行对照。他们在胚胎移植前1 d给予培养细胞，观察到1～3次移植失败的患者不能从治疗中获益，但4次或4次以上移植失败的患者的植入率、临床妊娠率和活产率显著增加。而且该方法对裂解期胚胎移植的RIF患者和较薄的子宫内膜厚度的患者都有效。

四、LIT中HLA的作用

通过对父系HLA异型和血型抗原的母体抗体的产生证明，通常存在于胎儿的父系抗原可以刺激母体免疫系统[27]，Moffett等[28]提出了可能的潜在机制来解释为什么母体的同种异体反应T细胞不会攻击胎儿滋养层。当绒毛合胞体滋养层不表达HLA-I类或II类分子时，T细胞不能与主胎盘屏障结合。此外，多绒毛滋养细胞(EVT)只表达HLA-I类而不表达II类，因此不能作为APC启动对母体CD4+T细胞的直接等位基因识别。即使表达的HLA I类分子也不常见，包括HLA-C、HLA-G和HLA-E。然而，诱导耐受性的关键分子是HLA-G，一个具有独特特征的单晶分子。这种分子可以形成一个同质二聚体，并与高亲和力的蜕膜APC (LILRB1)表达的抑制受体结合。人类白细胞抗原(HLA)分子是免疫系统中最多态性的分子，在激活外来抗原的同种免疫应答中起着重要作用。经典的HLA II类(HLA-DR、HLA-DQ、HLA-DP)和I类(HLA-A、HLA-B)基因在滋养细胞中不表达，因此这些类中没有母体T细胞介导的细胞毒性反应。然而，细胞表达HLA-G，一种非经典的I类基因，直接或通过HLA-E介导的方式可以使滋养细胞不受NK细胞的识别。考虑到HLA-G仅表达于胎盘组织的母体胎儿界面，它被认为是母亲对胎儿免疫耐受的主要因素。已经证明，当父母共享一些相似的HLA抗原时，同种异体免疫反应不会正常发生，从而引发流产过程[29]。

五、LIT可能的副作用

尽管大多数研究声称LIT没有对母亲和婴儿产生副作用，但其安全性并没有完全的研究。有关LIT最常见的产妇并发症是病毒感染(肝炎和巨细胞病毒)、流感样症状和发烧(输血反应)。胎儿(早产、宫内生长受限、胎儿死亡、发育不良)和新生儿(新生儿血小板减少和先天性畸形)比较，其比率有统计学差异，治疗组为3%，安慰剂组为4%[30]。为了保证LIT的安全性，Motak等[17]通过对患者的长期监测发现，LIT对治疗女性或新生儿的免疫系统没有任何负面影响。当然，为了保证LIT的安全性，还需要进行大样本量的长期跟踪研究。

六、总结

反复种植失败是现代生殖医学研究的难点和热点问题，虽然RIF的病因及主要机制尚未完全阐明，但近年的文献支持LIT对RIF的效果。最近的研究证明，通过增强APCA、PIBF、Ab2和MLR-BF的表达，以及降低细胞因子的Th1/Th2比率和改变细胞因子的产生，LIT会导致母体免疫系统发生变化，从而可能维持妊娠，但需要进一步研究上述因素在母体胎儿界面的作用及其保护妊娠的机制。考虑到在LIT的RIF和RPL患者中获得的具有争议性的结果，有必要确定合适的纳入和排除标准，以便在此类治疗中招募患者。此外，还需要一份标准的协议，明确说明淋巴细胞的制备方式、淋巴细胞的免疫剂量、应用时间以及给药途径。