衍生化-磁固相萃取高效液相色谱荧光检测内分泌干扰物

孙怡琳 亢 洋 郑龙芳 张琬茹 马爱新赵 建 王 晓 赵先恩*

1(曲阜师范大学化学与化工学院，山东省绿色天然产物与医药中间体高校重点实验室，曲阜 273165)2(齐鲁工业大学(山东省科学院)，山东省分析测试中心，山东省中药质量控制技术重点实验室，济南 250014)

1 引 言

近年来，三氯生(TCS)、β-雌二醇(E2)、壬基酚(NP)和4-辛基酚(OP)作为典型的环境内分泌干扰物(EDCs)引起了人们的广泛关注[1]。目前，在食品、日用品，甚至饮用水中不同程度地发现了内分泌干扰物[2]。流行病学研究显示，某些动物和人类的生殖发育系统和行为异常以及肿瘤发生率上升，与环境内分泌干扰物密切相关[3]。毒理学研究表明，环境内分泌干扰物在浓度极低时就能对生命体造成严重威胁[4]。因此，检测食品、日用品和环境水样中极微量内分泌干扰物对质量监督与控制具有重要意义。

已报道内分泌干扰物分析检测方法主要有气相色谱-质谱法(GC-MS)[5，6]、液相色谱串联质谱法(HPLC-MS)[7，8]、固相萃取高效液相色谱法(HPLC)[9]、超分子溶剂萃取高效液相色谱法[10]和免疫法[11]。免疫法在生物基质的内分泌干扰物检测中应用广泛，但其无法区分具有相似结构的内分泌干扰物，并且在检测过程中也容易发生交叉干扰反应。GC-MS、HPLC-MS法报道较多，但样品制备复杂，衍生化条件苛刻，仪器价格较昂贵。在HPLC分析方法中，主要采用紫外检测(UV)、荧光检测(FLD)或电化学检测(ECD)法，但这3种HPLC直接检测方法的灵敏度有限，而且受实际样品复杂基质干扰严重，常难以取得令人满意的结果。采用柱前衍生技术是提高检测灵敏度行之有效的手段[12,13]。He等[14]将衍生化试剂4′-甲酰氯罗丹明用于食品中生物胺的分析，显著提高了检测灵敏度，降低了基质效应。磁固相萃取技术(MDSPE)是近年发展起来的一种新型样品前处理技术。黄维等[15]将MDSPE引入尿样的预处理中，结合 HPLC-FLD，对1-羟基芘进行分析测定。目前，柱前衍生技术与磁固相萃取技术相结合，已开始应用于HPLC-MS联用分析，与传统方法相比具有显著优势[16]。磁性氧化石墨烯对于罗丹明类化合物具有良好的吸附能力[17]，基于此，本研究采用2′-甲酰氯罗丹明(RHB-Cl)作为柱前衍生化试剂，联合磁性氧化石墨烯分散固相萃取技术，建立了内分泌干扰物的高灵敏HPLC-FLD分析方法，实现了牛奶、牙膏和生活废水中4种内分泌干扰物的快速衍生、富集、净化。本方法具有简便、快速、灵敏度高等优势。

2 实验部分

2.1 仪器与试剂

Agilent 1260高效液相色谱仪，配备四元梯度泵、在线真空脱气机、荧光检测器、自动进样器、恒温柱温箱(美国Agilent公司); 旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂); 超声波清洗器(浙江昆山超声仪器有限公司); XW-80A漩涡混匀器(上海精科实业有限公司); SC-06低速离心机(安徽中科中佳科学仪器有限公司); SHA-C水浴恒温振荡器(金坛市金南仪器制造有限公司)。

壬基酚(Nonylphenol，NP，99%)，4-辛基酚(4-octylphenol，OP，99%)，β-雌二醇(β-estradiol，E2，99%)，三氯生(Triclosan，TCS，99%)均购自百灵威科技有限公司; 乙腈、甲酸(色谱纯，Sigma公司)。其它试剂均为分析纯试剂; 衍生化试剂2′-甲酰氯罗丹明(RHB-Cl)为本实验室合成。

2.2 RHB-Cl的合成

向三口烧瓶中加入1.0 g罗丹明B，足量1,2-二氯乙烷，缓慢滴加2 mL POCl3。反应混合物回流4 h，冷却，旋蒸除去溶剂，得到2′-甲酰氯罗丹明(RHB-Cl)。该产品无需进一步纯化，直接配制衍生化试剂用于衍生化反应[18]。

2.3 溶液配制

称取适量TCS、E2、NP和OP标准品，分别溶于乙腈，配制成0.01 mol/L的标准溶液，相应低浓度的标准溶液用乙腈稀释而成。取适量4种单标溶液配制混合标准溶液(1.0×10-4mol/L)。称取52.4 mg RHB-Cl，用乙腈溶解并定容至10 mL，配制成0.01 mol/L RHB-Cl溶液。

2.4 衍生化方法

安培瓶中加入200 μL混合标准溶液(或实际样品提取液)、200 μL 衍生试剂(0.01 mol/L)、300 μL Na2CO3-NaHCO3缓冲液(pH 9.5)，封口后涡旋混匀，于室温(20℃)反应5 min，加入50 μL 50%(V/V)冰乙酸溶液调节至pH 3～5，该衍生溶液用于下一步富集净化。衍生化反应示意图见图1。

图1 2′-甲酰氯罗丹明与酚类化合物的衍生化反应Fig.1 Derivatization reaction between 2′-carbonyl chloride rosamine (RHB-Cl) and phenolic endocrine disruptor compounds

2.5 磁固相萃取

向衍生溶液中加入15 mg磁性氧化石墨烯，于25℃水浴恒温振荡15 min，磁分离，弃上清液，加入洗脱剂甲醇-乙酸(9∶1，V/V)1 mL，超声处理5 min，借助磁铁分离上清液，并转入另一试管，定容至1 mL，过0.45 μm滤膜后，取20 μL供分析。

2.6 HPLC条件

色谱柱：Hypersil BDS C18柱(200 mm×4.6 mm，5 μm，大连依利特分析仪器有限公司)。流动相：A相为10%(V/V)乙腈溶液(含0.1%(V/V)甲酸)，B相为乙腈(含0.1%(V/V)甲酸)。梯度洗脱程序：0～2 min, 50%～70% B; 2～7 min，70%～85% B; 7～7.5 min，85%～100% B; 7.5～12 min，100% B。流速： 0～7.5 min，1.0 mL/min; 7.5～12 min，1.5 mL/min。进样量20 μL，柱温30℃。荧光激发波长(λex)和发射波长(λem)分别为554 nm和570 nm。

2.7 样品前处理方法

2.7.1牙膏样品前处理准确称取样品1.000 g于50 mL尖底离心管中，加入25 mL乙腈-水(9∶1，V/V)作为提取溶剂，超声波提取20 min，冷却至室温，以5000 r/min离心10 min，上清液经0.45 μm滤膜过滤，取10 mL滤液作为试样溶液，备用。

2.7.2牛奶样品前处理准确量取牛奶10 mL于50 mL尖底离心管中，加入20 mL乙腈，旋涡振荡混匀10 min，静置30 min以沉淀蛋白质，3000 r/min离心30 min，吸出上清液，再加入2 mL乙腈洗涤沉淀，合并上清液，于60℃水浴中氮吹至0.2 mL。

2.7.3生活废水样品前处理取5 mL生活废水于尖底离心试管中，加入1 mL氯仿，室温下漩涡振荡萃取3 min，5000 r/min离心6 min，精确吸取下层有机相，氮吹至干，用1 mL乙腈复溶后待衍生化。

3 结果与讨论

3.1 HPLC条件优化

图2 4种内分泌干扰物衍生物的高效液相色谱荧光(HPLC-FLD)色谱图Fig.2 Chromatogram of the four kinds of endocrine disruptor derivatives with RHB-Cl by high performance liquid chromatography-fluorescence detection (HPLC-FLD)E2：β-雌二醇; TCS：三氯生; OP：4-辛基酚; NP：壬基酚。E2: β-estradiol; TCS: triclosan; OP: 4-octylphenol; NP: nonylphenol.

通过对比不同色谱柱(Hypersil BDS、ODS以及Agilent Zorbas不同品牌和规格的色谱柱)、调整梯度洗脱程序及流动相pH值，最终确定了如2.6节所述的分离条件，4种内分泌干扰物衍生物在12 min内实现基线分离，HPLC-FLD检测色谱图见图2。由于罗丹明B分子底环上2′位的羧基易与氧杂蒽环上相连接的碳发生环化，整个分子异构化为不带正电荷的结构，需添加0.1%甲酸于流动相中，才能得到良好的峰形。采用Agilent 1260 HPLC-FLD仪器的在线荧光光谱扫描功能，结合荧光分光光度计扫描，确定4种衍生物HPLC检测的最佳激发和发射波长分别为554和570 nm。

3.2 衍生条件的优化

RHB-Cl是典型的碳酰氯类衍生试剂，在适当的碱性水-乙腈溶液中，对酚羟基的衍生速率较快。首先考察了pH值对衍生反应的影响，对比pH 9.0～10.5 Na2CO3-NaHCO3缓冲液条件下衍生化效果，结果表明，pH为9.0～9.5时，4种衍生物的峰面积随pH值增大而显著增大; 当pH>9.5时，其峰面积随pH值增大而显著降低，在pH=9.5时达最大值(图3A)。当pH值继续增加，强碱导致衍生试剂和衍生物的分解。因此最终选用pH 9.5的Na2CO3-NaHCO3缓冲液进行衍生化反应。

考察了4种衍生产物的峰面积随衍生试剂用量、衍生时间、温度的变化规律。对衍生试剂用量考察结果表明，随衍生试剂用量的增多，衍生物的峰面积逐渐增大，当衍生试剂用量为4种衍生物总量的100倍时，衍生物的峰面积最大，进一步增加衍生试剂用量未见峰面积继续增大(图3B)。对衍生时间、温度考察结果表明，随衍生时间延长，衍生物的峰面积明显增大，衍生5 min时峰面积最大; 随衍生温度升高，在15～50℃范围内，衍生物的峰面积变化不显著，当温度超过50℃，衍生物的峰面积会降低(图3C和图3D)。这可能是由于时间过长、温度过高导致衍生物分解。因此，选择衍生反应5 min、室温(20℃)作为最佳条件。

图3 内分泌干扰物衍生化反应条件优化：(A)pH值; (B)衍生试剂用量; (C)反应时间; (D)反应温度Fig.3 Optimization of derivatization reaction conditions: (A) pH value; (B) molar ratio of derivatization reagent for four derivatives; (C) reaction time; (D) reaction temperature

3.3 MDSPE条件优化

考察了磁性氧化石墨烯用量、萃取时间、解吸剂种类和解吸时间的变化对萃取效果的影响，萃取后均将溶液定容至1 mL。对磁性氧化石墨烯用量考察结果表明，磁性氧化石墨烯用量从5 mg增至15 mg时，萃取效率明显增加; 继续增加其用量，萃取效率无明显增加(图4A)。萃取时间从5 min增至15 min时，萃取效率明显增加，继续增加萃取时间，萃取效率无明显增加(图4B)。对甲醇、乙醇、乙腈、甲醇-乙酸(9∶1，V/V)、乙醇-乙酸(9∶1，V/V)分别为解吸剂时的萃取效果考察结果表明，当使用甲醇-乙酸(9∶1，V/V)为解吸剂时萃取效率达最大值。解吸时间从1 min增至3 min时，萃取效率明显增加，继续增加解吸时间，萃取效率无明显增加。最终选用磁性氧化石墨烯用量15 mg、萃取时间15 min、甲醇-乙酸(9∶1，V/V)为解吸剂、解吸时间3 min为最佳条件。

图4 磁固相萃取条件优化：(A)磁性氧化石墨烯(MGO)用量; (B)萃取时间Fig.4 Effects of magnetic dispersive solid phase extraction (MDSPE) conditions: (A) amount of magnetic graphene oxide (MGO); (B) extraction time

3.4 方法分析性能

3.4.1线性回归方程、检出限、定量限与精密度在空白牛奶基质乙腈溶液中添加标准样品，按照衍生化和MDSPE方法进行处理，依据峰面积Y和实际进样量X进行线性回归，所得各衍生物的线性回归方程、相关系数、检出限(S/N=3)和定量限(S/N=10)见表1，线性相关系数均大于0.981,检出限为1.1～1.9 ng/L，定量限为4.0～7.5 ng/L。在相同实验条件下，制备混合标准品衍生液，平行分析6次，保留时间和峰面积的相对标准偏差见表1。结果表明，本方法的精密度良好。

3.4.2与文献方法的比较本方法与文献报道的相关方法在检出限、样品体积、分离时间、检测方法、 衍生化(或直接检测)等方面的对比见表2。本方法的检出限仅为不经衍生化的直接HPLC-UV的检出限的几十分之一[19]、经SPE前处理的HPLC-UV或HPLC-FLD检出限的几十分之一或几分之一，而且本方法所需样品量小，故本方法在检出限和取样量方面具有明显优势[20，6]。与经衍生化SPE的GC-MS方法相比，检出限相当，但本法所需衍生温度更低、衍生时间更短，具有一定优势[7]。这一方面得益于本方法所采用的衍生化试剂结构，RHB-Cl具有庞大的分子共轭体系，具有显著的荧光增敏效果。另一方面，本方法采用MDSPE技术，达到了富集净化样品的目的。另外，RHB-Cl衍生化方法条件温和、快速，与MDSPE技术结合，能够带来样品前处理的优势。HPLC分离时间短，HPLC仪器与荧光检测器在普通实验室较为常见，因此本方法具有一定的普适性。

表1 4种衍生物的线性回归方程、相关系数、检出限、定量限与精密度(n=6)

Table 1 Linear regression equations, correlation coefficients(R), limits sof detection (LODs), limits of quantification (LOQs) and precision of the four derivatives (n=6)

苯酚衍生物Phenolderivative线性回归方程Linear regressionequation相关系数Correlationcoefficient(R)检出限LOD(ng/L)定量限LOQ(ng/L)相对标准偏差 RSD (%, n=6)保留时间Retention time(min)峰面积Peak areaE2y=24.27x+0.00970.9881.97.52.300.89TCSy=77.88x-0.00060.9811.14.00.671.63OPY=39.62x-0.00420.9961.87.01.530.61NPy=37.32x-0.00280.9991.87.02.360.41y: Peak area; x: Injection amount, pmol.

表2 本方法与文献方法的比较

Table 2 Comparison of this method with the reported methods

方法Method衍生试剂Derivatizationreagent温度Temperature(℃)时间Time(min)检测波长Detectionwavelength(nm)分离时间Separationtime(min)样品体积Samplevolume(mL)检出限 LODs(ng/L)E2TCSOPNP参考文献RefsHPLC-UV---UVλex=28015-50---[19]SPE-HPLC-UV---UVλex=28043040---[20]SPE-HPLC-FLD---λex/λem=275/30085500--2.04.0[6]SPE-GC-MSMSTFA7590-355002.1-1.22.4[7]MDSPE-HPLC-FLDRHB-Cl205λex/λem=554/570115.01.91.11.81.8ThismethodMSTFA: N-methyl-N-(trimethylsilyl)trifluoroacetamide; -: Not reported.

图5 生活废水中4种内分泌干扰物衍生物的色谱图Fig.5 Chromatogram of 4 kinds of endocrine disruptor derivatives in waste water sample

3.5 回收率与实际样品分析

按照2.7节所述的实际样品前处理方法，采用最优化实验条件，对3种实际样品中4种内分泌干扰物进行了测定，结果见表3，加标回收率在73.9%～118.3%之间，能够满足实际检测要求。同时，测定曲阜本地市售牛奶(某品牌盒装牛奶)、牙膏及生活废水(取自本地某垃圾站)中4种内分泌干扰物含量，结果见表3，牛奶、牙膏中含有较少的内分泌干扰物，生活废水中含有较多的内分泌干扰物，需加强生活垃圾的处理与监管，可适当采用光催化技术等[21]，以减少对人类健康和生态环境的危害。其中生活废水样品色谱图见图5。

4 结 论

利用高灵敏荧光衍生化与MDSPE技术相结合的策略，建立了4种内分泌干扰物的HPLC-FLD分析方法。本方法具有简便、快速和灵敏度高等优势，且具有良好的适用性。对实际样品检测结果表明，牛奶、牙膏中含有较少的内分泌干扰物，而生活废水中含有相对较多的内分泌干扰物。

表3 3种实际样品中内分泌干扰物的含量及加标回收实验结果(n=3)

Table 3 Contents and recoveries of endocrine disruptor compounds in three real samples (n=3)

分析物Analytes牙膏 Toothpaste含量Content(ng/L)加标量Added(ng/L)回收率Recovery(%)牛奶 Milk含量Content(ng/L)加标量Added(ng/L)回收率Recovery(%)生活废水 Waste water含量Content(ng/L)加标量Added(ng/L)回收率Recovery(%)E2NDTCS2.66OPNDNPND10.00118.380.00116.9800.00118.25.0092.240.0090.040093.410.0092.080.0092.480093.310.0081.580.0080.280083.14.09NDNDND10.00101.680.00102.6800103.85.0073.940.0074.640076.310.0096.280.0095.280098.010.00104.280.00102.9800103.85.992.794.756.3710.00111.580.00109.7800113.15.0079.840.0078.940081.210.00104.480.00105.4800106.610.00113.480.00112.5800114.8