饱和臭氧水对脱氧雪腐镰刀菌烯醇的降解研究

谭 琳，杜华英，吴国平，汤凯洁

(江西农业大学食品科学与工程学院，江西南昌330045)

脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol，DON)，又名呕吐毒素(vomitoxin)。属B型单端孢霉烯族毒素，主要是由禾谷镰刀菌、黄色镰刀菌等真菌产生的次级代谢产物。DON常污染于粮谷作物中，食用含此毒素的食品或饲料，通常会对人或动物产生毒害作用，表现为呕吐、腹泻、恶心等症状，严重者可能导致组织病变或死亡[1]。因此我国国家标准2017年规定食品中DON的限量标准为1 mg/kg[2]。粮谷类作物在生产、贮存、加工等环节，由于气候和环境因素的影响，尤其是高热高湿的条件下更容易产生此毒素[3]。因此研究合理的措施降解食品或者饲料中的DON含量具有重要的意义。目前见文献报道DON的降解处理方法有物理方法和化学方法。如169～243 ℃下油煎加热处理可以降解21%～28%的DON[4]，200 ℃处理玉米样品15～20 min，DON可以降解11.58%～15.26%[5]；1 kg玉米加300 mL水和50 g亚硫酸钠，121 ℃加热1 h后DON降解87%[6-7]，Trenholm等[7]研究被DON污染的小麦经0.1 mol/L碳酸钠浸泡24～72 h后DON降解42%～100%，效果良好[8]；物理降解DON需高热和加压设备，成本较高；化学降解DON效果好，但可能有化学试剂的残留，引入新的不安全因素。目前新兴的生物降解处理研究也有很多报道[9-13]。但安全有效的物理降解措施一直成为研究的热点，国内外学者利用臭氧或紫外灯就农作物中污染的真菌毒素做过很多研究，如降解黄曲霉毒素[14-17]，而对DON的降解研究还较少。考虑到臭氧处理完样品后，在常温常压下它可以很快分解成氧气，因此几乎没有有害物质残留，也不会造成人身损害，1997年美国食品药品监督管理局已经批准臭氧可作为食品安全物质直接加入食品中[18]。另外有学者研究过臭氧降解DON后的面粉品质及产物毒性较低[19-21]，因此使用臭氧降解后的安全性较高。本文研究了臭氧水降解DON标准品和面粉加标中DON的效果，为评价臭氧水降解饲料或者粮谷类污染DON的应用提供了一些理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

DON标准品，西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司；甲醇、乙腈均为色谱纯，美国格雷斯公司；盐酸、氢氧化钠、硫代硫酸钠、硫酸均为分析纯，天津市永大化学试剂有限公司；碘化钾(分析纯)，上海银典化工有限公司；面粉、小麦、玉米等样品，购于超市；SupelTMTox DON SPE净化柱(55316-U型)，美国西格玛公司；超纯水由Milli-Q纯水仪制备，法国密理博公司。

1.2 仪器与设备

Waters E2695高效液相色谱仪(美国Waters 公司，配DAD检测器，四元泵)；C18色谱柱(4.6 mm × 250 mm，5.0 μm)，Waters公司；PHS-TPB型酸度计(上海大普仪器有限公司)；XM-T5型欣美臭氧发生器(青岛欣美净化设备有限公司)；HC-2518R型高速冷冻离心机(安徽中科中佳科学仪器有限公司)；QT-2型旋涡混合器(上海琪特分析仪器有限公司)；WD-12氮吹仪(杭州奥盛仪器有限公司)。

1.3 实验方法

1.3.1 试剂的配制和样品的处理 DON标准液的制备：称取脱氧雪腐镰刀菌烯醇标准品1 mg，用流动相乙腈-水(1 ∶ 9,V/V)1 mL溶解，旋涡震荡30 s，制成1 000 μg/mL的DON标准贮备液，放置4 ℃冰箱存储备用。不同pH的超纯水制备：将超纯水用0.10 mol/L HCl、0.01 mol/L HCl、0.10 mol/L NaOH和0.01 mol/L NaOH调节pH分别为：4.00、4.50、5.00、5.50、6.00和6.50，临用时制备。臭氧水制备：实验所用臭氧水是采用高纯氧气通过臭氧发生器所得到的臭氧气体直接通入水中制得。样品制备：颗粒样品经粉碎机粉碎后过40目筛后取粉末备用。

1.3.2 高效液相色谱流动相的优化 高效液相色谱条件：进样量20 μL、柱温30 ℃、紫外检测波长220 nm，流动相流速1 mL/min。

1.3.3 标准曲线的制作 取20 μL浓度为0.01，0.10，0.50，1.00，2.00，5.00，10.00 μg/mL的DON标准工作液，按HPLC流动相优化了的条件进行检测，得到不同浓度DON标准品的峰面积，根据峰面积和标准液浓度建立关系曲线，计算R2和回归方程。

1.3.4 臭氧水稳定性的研究 在通风橱内臭氧气体流量控制为0.5 L/min(所有实验均为此流量)，稳定后自导管通入含水的烧杯中，通过调节臭氧发生器的时间对不同pH和温度的水进行优化，经碘量法[19]测定后得到臭氧含量高的臭氧水。

(1)充臭氧时间对臭氧含量的影响。选择pH为6.50的超纯水50 mL，室温条件下通入超纯水的臭氧时间控制为0，1，2，3，4，5，6，7，8，9，10 min，通完气体后立即用碘量法检测水中臭氧的含量，以确定臭氧含量达到饱和时充臭氧的最佳时间。

(2)不同pH对臭氧含量的影响。考虑不同酸度对臭氧稳定性的影响，选取pH值为4.00、4.50、5.00、5.50、6.00和6.50的超纯水50 mL，水温35 ℃充入臭氧时间为5 min，对比不同pH值条件下臭氧水中臭氧的含量。

(3)不同温度对臭氧含量的影响。取pH 4.00的超纯水50 mL，充入臭氧时间均控制为5 min，对比不同温度条件下：0，10，20，30，35，40，45，50，55 ℃水中臭氧的含量，确定臭氧较高含量的温度。

1.3.5 臭氧水对DON标准品的降解研究 取50 μg/mL的DON标准品20、40、100、200 μL加入干净的进样瓶中并60 ℃烘干，冷却至室温后用0 ℃超纯水配制的饱和臭氧水1 mL立即加入各进样瓶中，10 min后立即60 ℃加热5 min以分解掉水中剩余的臭氧，然后旋涡震荡30 s进行高效液相色谱检测，另做5组平行实验。得到臭氧水对不同含量DON标准品的降解率。

1.3.6 臭氧水降解面粉DON的应用研究 (1)面粉样品处理。DON面粉加标制备：称取2.000 g新鲜面粉(未检出DON)于干净的10 mL塑料离心管中，然后加入100 μg/mL的DON标准品100 μL自然风干后混匀。

臭氧水降解加标面粉 ∶ 选取面粉 ∶ 水的质量比1 ∶ 1、1 ∶ 2、1 ∶ 3、1 ∶ 4、1 ∶ 5、1 ∶ 6、1 ∶ 7和1 ∶ 8进行试验，用所制得的臭氧水立即按上述比例加入1 g加标的面粉中并不断手动震荡混匀，润湿后静置10 min，再40 ℃鼓风干燥烘干待用。

(2)面粉样品中DON的提取。取1.000 g上述干燥的面粉样品置于10 mL塑料离心管中，加入3 mL乙腈-水(84 ∶ 16,V/V)，超声提取5 min后于10 000 r/min离心10 min后取上清液，重复提取3次，收集上清液在60 ℃条件下氮吹干后用1 mL乙腈-水(1 ∶ 9,V/V)复溶，旋涡震荡30 s，复溶液经过0.22 μm滤头转入液相自动进样瓶中4 ℃冰箱保存备用。

(3)面粉样品净化。取(2)制备样液加入SupelTMTox DON SPE净化柱(55316-U型)中，然后加入2 mL乙腈-水(84 ∶ 16,V/V)分2次(2 mL × 2)过柱，所得滤液用10 mL离心塑料管收集，60 ℃氮吹干，所得残留物用1 mL乙腈-水(1 ∶ 9,V/V)复溶，旋涡震荡30 s，复溶液经过0.22 μm滤头转入液相自动进样瓶中进行高效液相色谱分析。

(4)臭氧水对饲料样品中DON降解效果研究。取0 ℃超纯水配制的饱和臭氧水按样品：水的质量(1 ∶ 5)加入小麦、玉米、面粉样品中静置10 min，重复上面臭氧水对面粉样品的提取和净化操作，研究臭氧水对不同样品中DON的降解效果。

1.3.7 降解率计算 臭氧水处理DON降解率计算公式：

(1)

式中：C(t)为样品中DON经臭氧水处理t时间后的浓度；C(0)为样品中DON的初始浓度。

1.3.8 数据处理与统计分析 实验重复至少3次，HPLC测定中采用empower软件进行数据采集，数据采用Excel、IBM SPSS Statistics 22.0软件进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 高效液相色谱流动相的优化

目前见文献[22-23]和国标报道[24]的高效液相色谱法测定DON方法中流动相有甲醇-水和乙腈-水，本试验设计了甲醇-水(2 ∶ 8,V/V)，甲醇-水(1 ∶ 9,V/V)，乙腈-水(2 ∶ 8,V/V)，乙腈-水(1 ∶ 9,V/V)4种流动相对DON色谱峰的出峰时间和峰型的影响。4种流动相的高效液相色谱图见图1。

[a.乙腈-水(1 ∶ 9,V/V)；b.甲醇-水(2 ∶ 8,V/V)；c.甲醇-水(1 ∶ 9,V/V)；d.乙腈-水(2 ∶ 8,V/V)][a.acetonitrile-water(1 ∶ 9,V/V)；b.methanol-water(2 ∶ 8,V/V)；c.methanol-water(1 ∶ 9,V/V)；d.acetonitrile-water(2 ∶ 8,V/V)]图1 4种不同流动相高效液相色谱图Fig.1 Chromatograph of different four mobile phase

由图1可以看出，乙腈-水(1 ∶ 9,V/V)的峰形和乙腈-水(2 ∶ 8,V/V)的峰形都漂亮，但乙腈-水(2 ∶ 8,V/V)的出峰时间太早(tR为4.37 min)，在后续加标实际样品检测中容易与杂质峰出峰时间重叠，影响DON的定性和定量分析；而甲醇-水(1 ∶ 9,V/V)和甲醇-水(2 ∶ 8,V/V)的峰型都欠佳，甲醇-水(1 ∶ 9,V/V)的峰型明显展宽，影响检测限和灵敏度；甲醇-水(2 ∶ 8,V/V)的峰型对称性较差，并且有“拖尾”现象。因此，后面的实验都采用乙腈-水(1 ∶ 9,V/V)为流动相。

2.2 DON标准曲线

图2 DON标准曲线Fig.2 Calibration curve of deoxynivalenol

DON标准品浓度与峰面积的关系曲线如图2所示。

图2可知，DON标准液在0.01～10 μg/mL内线性关系良好，回归方程为y=19 274x-236.41，相关系数R2=0.999 9，该方法可以满足DON的痕量检测。

2.3 臭氧水稳定性的实验

有报道臭氧水对真菌毒素具有一定的降解效果[25-26]，因此研究臭氧在水中的稳定性可以更好地控制DON的降解条件。臭氧在水中的含量和稳定性主要受充臭氧时间、水的pH和温度等条件的影响，试验结果如图3所示。

由图3(a)可以看出充臭氧时间在0～1 min内臭氧的含量迅速上升，在5 min左右趋近饱和，达到21.8 mg/L，5 min以后臭氧的含量变化不明显，因此后面的实验选择充臭氧时间为5 min。方敏等[26]研究报道臭氧在pH为4以下的酸性水中稳定性不高，在碱性条件下臭氧分解又会加剧，因此本试验选择水的pH范围为4.00～6.50进行研究，由图3(b)pH的影响可以看出，当pH从4.00逐渐升高至6.50，臭氧含量从31.0 mg/L下降至21.8 mg/L，说明臭氧在较高pH值稳定性差。图3(c)显示臭氧水在0～60 ℃内，温度越低臭氧的稳定性越好，在50 mL的超纯水中充入臭氧5 min后0 ℃时溶解量最大达到73.2 mg/L。因此，从图3(a)、3(b)和3(c)可以看出，温度为0 ℃，pH值为4.00，充臭氧时间为5 min后，臭氧在水中的溶解度达到饱和值73.2 mg/L。

2.4 臭氧水对DON标准品的降解研究

(a.充臭氧时间对臭氧在水中溶解的影响；b.pH对臭氧在水中溶解度的影响；c.温度对臭氧在水中溶解度的影响)(a.Effect of time on the dissolution of ozone in water；b.Effect of pH on the dissolution of ozone in water；c.Effect of temperature on the dissolution of ozone in water)图3 时间、pH和温度对臭氧在水中溶解度的影响Fig.3 The effect of ozone solubility in water on different time,pH and temperature

影响臭氧水对DON降解效率的主要因素有降解时间和臭氧水与DON的最佳比例。根据Sun等[27]研究报道，饱和臭氧水处理DON标准品7 min降解率达到最大。因此，本实验采用降解时间为10 min后测定其降解率，然后进一步优化臭氧水和DON的最佳比例。

图4为1 mL饱和臭氧水处理1 μg、2 μg、5μg和10 μg的DON标准品的降解率，由图4可以看出，低浓度的DON降解率较高，随着DON含量的增加其降解率下降，1 μg DON经过臭氧水处理后降解率达99.6%，2 μg的DON降解率为99.4%，5 μg的 DON降解率为99.0%，可以认为DON接近被完全降解；而当DON含量继续增加到10 μg时，降解率为98.5%。由此可以看出当固定臭氧水的量一定时，随着DON含量的增加，DON的降解率缓慢地下降，造成这种趋势可能的原因是臭氧水与DON比例的变化导致的，因此，后面的面粉样品的降解采用臭氧水：DON为1 mL 73.2 mg/L，5 μg。

图4 0 ℃饱和臭氧水对不同含量DON标准品的降解Fig.4 0 ℃ saturated ozone water on the degradation of different content of standard DON

图5是DON经臭氧水降解后和降解前的高效液相色谱图。由图5(a)可以看出，经过臭氧处理后，DON含量明显下降，且在DON色谱峰的左右各出现一个新的色谱峰x和y，这两个峰可能是DON的降解产物。由于臭氧降解DON的产物量非常少，难于收集到，因此，目前还未见报道该降解产物的具体结构，仅有根据相关软件模拟推测的结构。据王莉等[28]报道，臭氧对DON的降解，作用方式符合Criegee机制，即DON中的C9-C10双键会被臭氧打开，形成加成反应，加入了3个氧原子，最终分解成含有醛酮基团的羰基化合物。另外Sun等[27]采用Q-TOF MS也检测到DON的两种降解产物，并推测其结构和理化性质非常接近DON。从本实验图5两种未知物x和y的出峰时间也可以看出，这两种降解产物的极性与DON非常接近，这与Sun等[27]的推测一致。

2.5 臭氧水降解加标面粉中DON的应用研究

在使用臭氧水进行降解加标面粉试验前，对5.0 mg/kg的加标面粉经SupelTMTox DON SPE净化柱净化前后进行分析，计算DON的回收率。加标面粉净化前后的高效液相色谱图如图6所示。

a.DON降解后的高效液相色谱图；b.饱和臭氧水高效液相色谱图；c.DON标准品高效液相色谱图a.chromatograms of DON degradation products；b.ozone water at pH 4.00；c.chromatograms of DON standard图5 DON及DON降解产物色谱图Fig.5 Chromatograms of DON and DON degradation products

a.面粉加标5.0 mg/kg未净化色谱图;b.面粉加标5 mg/kg净化后色谱图a.chromatogram of spiked 5.0 mg/kg DON in flour with SupelTMTox SPE purification;b.chromatogram of spiked 5.0 mg/kg DON in flour without SupelTMTox SPE purification图6 加标面粉经SupelTMTox DON SPE净化柱前后色谱图Fig.6 Chromatogram of spiked flour with SupelTMTox SPE purification and without,respectively

图7 不同饱和臭氧水比例对加标面粉中DON的降解率(n=6)Fig.7 DON degradation rate of different ratio of saturated ozone water with flour (n=6)

由图6经SupelTMTox DON SPE净化柱处理前后的液相色谱图可以看出，该柱净化效果很好，可以明显去除多种杂质，经标准曲线回归方程计算，加标面粉的回收率在(97.2±1.7)%，能较好的满足检测需要。

臭氧降解小麦中的DON，高湿度可以提高降解率[21,25]，考虑面粉具有很强的吸水性，本实验设置8个不同饱和臭氧水与加标面粉的比例进行降解试验，结果见图7。

由图7可以看出，随着饱和臭氧水的增加，加标面粉中的DON降解率增大。当饱和臭氧水：面粉的质量比为5 ∶ 1时，降解率最大，为82.6%，继续增加水的含量，降解率几乎没有变化。

采用臭氧水5倍于样品质量的比例对面粉加标浓度分别为0.500、1.000、5.000 mg/kg面粉进行处理，经臭氧水处理前后的降解率如表1所示。

表1 饱和臭氧水对不同加标面粉中DON降解率和精密度(n=6)

从表1可以看出，面粉中不同加标浓度DON的降解率在82.53%～84.81%，RSD在0.61%～1.23%，可以看出臭氧水降解面粉样品中的DON具有预期的效果。本实验中加标面粉中的DON(5.00 mg/kg)的降解率较余以刚等[19]报道的面粉中加标DON(4.95 mg/kg)的降解率高出一倍以上。

2.6 臭氧水处理阳性饲料级和食用级样品中DON的应用研究

DON在饲料中的污染很普遍，也很严重，根据江苏奥迈生物科技有限公司分析中心对新上市的玉米中霉菌毒素报告，呕吐毒素的污染率为100%，检测量在300～400 μg/kg。本实验室也检测了市场上购买到的30个样品，其中6个为饲料级的小麦样品，检出率为100%，检测量在3.91～6.92 mg/kg；食用级玉米和面粉样品各12个，其中有两个玉米和两个面粉样品未检出，检出率为83.3%，检测量在0.09～1.76 mg/kg。然后分别选择了6个小麦、玉米和面粉阳性样品进行降解试验，降解结果如表2。

表2 臭氧水对市售饲料样品中DON的降解率(n=6)

从表2可以看出，饱和臭氧水对阳性小麦、玉米和面粉样品中的DON进行处理后，样品中的DON均得到有效降解，降解率在82.46%～83.70%，RSD在0.89%～1.89%。由表2可以看出，阳性样品经臭氧处理后的DON检测值均低于1 mg/kg，符合国家标准。

3 结论与讨论

臭氧具有很强的氧化性，能氧化DON，使其毒性下降[28-29]。但臭氧在常温常压下稳定性较差，可自行分解为氧气。因此，研究制备饱和臭氧水的条件可以使DON降解率达到最大。饱和臭氧水受充臭氧时间、pH和温度的影响，在pH为4.0、温度0 ℃、体积为50 mL的超纯水中充入臭氧(流量0.5 L/min)5 min后可达到饱和，经碘量法测定，臭氧含量为73.2 mg/L。采用该饱和臭氧水对5 μg的DON标准品降解率可达99.0%，经高效液相色谱法检测到两个降解产物色谱峰x和y，产物的结构鉴定需要进一步的实验确定。对加标DON浓度为5 μg/g面粉降解时，当添加饱和臭氧水的量为面粉质量的5倍时，DON的降解率最高，为82.6%。据李焕[30]的报道，直接采用臭氧处理小麦麸皮易产生正已醛、壬醛等不良风味的挥发性物质，且持续时间长，而采用饱和臭氧水处理不仅无不良风味，还改善了面筋网络，提高了面筋品质。本试验采用饱和臭氧水对小麦、玉米和面粉不同阳性样品进行了降解研究，DON的降解率在82.46%～83.70%，降解后的DON均低于国家限量标准[2]，但该降解率不及臭氧水对DON标准品的降解率，推测可能的原因是样品中的面粉介质对臭氧的渗透有一定干扰作用。另据邵慧丽[29]和孙超[31]研究显示，臭氧处理可提高小麦粉的白度，而对其蛋白质、淀粉和脂肪酸等营养成分的影响不显著。因此采用臭氧水在谷类样品的使用安全性较高，结合本研究可以看出饱和臭氧水对DON的降解具有一定的应用潜力。