醉鱼草果实水部位化学成分及神经保护活性研究

张 伟，许双旺，吴德玲*，王桐生，许凤清,2,3，陈箫箫

1安徽中医药大学药学院；2中药饮片制造新技术安徽省重点实验室；3安徽省高校科研创新平台团队—中药饮片产地加工与炮制一体化关键技术研究创新团队；4安徽道地中药材品质提升协同创新中心，合肥230012

醉鱼草果实是马钱科醉鱼草属植物醉鱼草(BuddlejalindleyanaFort.)的果实。醉鱼草为多年生小灌木，广泛分布于长江以南地区，传统认为其具有祛风除湿、行气化痰、散瘀之功效[1]。近年来通过对醉鱼草全草、果实的研究发现，醉鱼草(包括果实)中主要含有黄酮类，三萜类，环烯醚萜苷类等成分，而且具有抗菌杀虫、保肝、解痉、镇静、抗氧化、利尿等生物活性[2]。课题组前期研究发现其中的部分成分具有保护脑神经细胞，避免其受MPP+所致的损伤作用，预示其在抗帕金森病药物的研究中具有一定的应用前景。本文主要对安徽歙县产醉鱼草(B.lindleyana)果实经石油醚、乙酸乙酯等有机溶剂萃取后的水溶性部位进行了化学成分研究，并采用MPP+诱导的SH-SY5Y细胞模型对部分化合物的神经保护作用进行了活性筛选研究。

1 材料与仪器

BruckerAM-400/600 MHz型超导核磁共振仪(Bruker，Bremerhaven，德国)。中压制备液相色谱仪(DrFlash-S系列，上海利穗科技有限公司，分离柱为SepaFlash预装柱：DN50×500 mm，40×400 mm，40×250 mm)；高压制备液相色谱仪(Waters 2545，美国Waters公司)；SephadexLH-20(50 μm，GE公司)；反相材料RP-18(50 μm，Merck公司)；YMC-PackODS-A，(250 mm×20 mm，5 μm，YieldMicroelectronicsCorp.)；大孔树脂(AB-8，天津光复精细化工研究所)；柱色谱硅胶(200～300目，青岛海洋化工厂)；薄层色谱用硅胶板(G、GF254，青岛海洋化工厂)；Milli-Q超纯水器(美国Millipore)；甲醇、乙腈为色谱纯(OCEANPAK)；乙醇为食用酒精；水为蒸馏水；其它试剂均为分析纯(天津市大茂化学试剂厂)。

胎牛血清(德国Serana公司)；胰蛋白酶(美国Sigma公司)；二甲基亚飒(DMSO，BestBio贝博)；噻唑蓝(MTT，美国Sigma)；1-甲基-4-苯基吡啶离子(MPP+，Sigma公司)；洁净工作台(SW-CJ-1F，苏净安泰)；5% CO2细胞培养箱(371直热式，Thermo公司，美国)；AIRTECH倒置显微镜(XSP-15CE，上海立光精密仪器有限公司)。

醉鱼草果实采自安徽省歙县，经安徽中医药大学药学院刘守金教授鉴定为马钱科醉鱼草(BuddlejalindleyanaFort.)的果实，原植物标本(编号：AZYZYC-SX-02)存放于安徽中医药大学药学院中药化学教研室；人神经母细胞瘤细胞株(SH-SY5Y细胞)由中科院上海细胞生物学研究所提供。

2 提取与分离

醉鱼草果实(10 kg)粉碎成粗粉后，采用乙醇-水(95∶5，50∶50)依次渗漉提取，渗漉液合并后减压浓缩至无醇味，加入水分散，依次加入石油醚、乙酸乙酯萃取，萃取后剩的水层离心后取上清液，蒸干得到C部位(3.5 kg)。将C部位水溶解后经AB-8大孔树脂(600×250 mm)吸附后，以乙醇-水梯度洗脱，得到0%、30%、60%和90%乙醇洗脱部位。取大孔树脂30%乙醇-水洗脱部位504 g以聚酰胺柱色谱(600×200 mm)分离，乙醇-水(0∶100，30∶70，60∶40，95∶5)梯度洗脱，依次得到四个洗脱流份，分别为C2-1、C2-2、C2-3、C2-4。

取C2-2(34 g)，经硅胶柱色谱(250×100 mm)吸附，使用二氯甲烷-甲醇(95∶5，90∶10，85∶15，80∶20，75∶25，50∶50，0∶100)梯度洗脱，TLC检识合并得到流份C2-2-1和C2-2-2。对C2-2-1流份反复使用Sephadex LH-20柱色谱及ODS反相柱色谱进行细分、纯化后，得化合物1(17 mg)。C2-2-2经反复Sephadex LH-20柱色谱、ODS反相柱色谱(甲醇-水系统)及高压制备液相色谱(甲醇-水系统)处理后，得化合物2(8 mg)和3(11 mg)。

取C2-1(367 g)，经硅胶柱色谱充分吸附后，使用二氯甲烷-甲醇系统梯度洗脱，各流份经TLC检识后合并，得到C2-1-1～C2-1-6共六个部分。C2-1-1经反复硅胶柱色谱、Sephadex LH-20柱色谱、ODS反相柱色谱处理，得化合物4(17 mg)，5(24 mg)，6(19 mg)。C2-1-2经反复Sephadex LH-20柱色谱、硅胶柱色谱、ODS反相柱色谱及高压制备液相色谱处理，得化合物7(41 mg)，8(10 mg)。C2-1-4借助中压制备色谱，利用甲醇-水(10∶90，20∶80，30∶70，40∶60，50∶50，60∶40，100∶0)梯度洗脱，得到C2-1-4-1～C2-1-4-6共6个流份，其中C2-1-4-3经反复ODS反相柱色谱及高压制备液相色谱纯化，得化合物9(6 mg)。C2-1-3经MCI柱色谱处理后，以甲醇-水(10∶90，15∶85，20∶80，25∶75，30∶70，100∶0)梯度洗脱，得到C2-1-3-1和C2-1-3-2两个部位，其中C2-1-3-1经常压ODS反相柱色谱和高压制备液相色谱纯化，得化合物10(8 mg)。

3 结构解析

化合物1 白色粉末(甲醇);1H NMR(600 MHz，pyridine-d5)δH：5.63(1H，d，J=11.3 Hz，H-11)，6.62(1H，dd，J=10.8，2.8 Hz，H-12)，4.94(1H，d，J=7.9 Hz，H-1′)，5.29(1H，d，J=8.0 Hz，H-1′′)，5.60(1H，d，J=7.9 Hz，H-1′′′)，5.79(1H，d，J=8.2 Hz，H-1′′′′);13C NMR(150 MHz，pyridine-d5)δ：38.6(C-1)，26.1(C-2)，82.6(C-3)，43.8(C-4)，47.7(C-5)，18.6(C-6)，32.5(C-7)，40.5(C-8)，54.8(C-9)，36.5(C-10)，126.4(C-11)，125.9(C-12)，136.3(C-13)，42.5(C-14)，33.0(C-15)，24.7(C-16)，40.6(C-17)，135.7(C-18)，38.3(C-19)，32.5(C-20)，35.5(C-21)，29.2(C-22)，64.6(C-23)，12.8(C-24)，18.5(C-25)，17.3(C-26)，20.8(C-27)，63.1(C-28)，24.6(C-29)，35.4(C-30)，104.2(C-1′)，77.2(C-2′)，84.6(C-3′)，77.2(C-4′)，70.5(C-5′)，17.2(C-6′)，105.0(C-1″)，74.0(C-2″)，76.4(C-3″)，78.3(C-4″)，77.6(C-5″)，61.3(C-6″)，104.0(C-1′′′)，75.6(C-2′′′)，78.8(C-3′′′)，72.8(C-4′′′)，72.2(C-5′′′)，63.1(C-6′′′)，102.8(C-1′′′′)，72.6(C-2′′′′)，72.1(C-3′′′′)，76.3(C-4′′′′)，70.4(C-5′′′′)，18.7(C-6′′′′)。以上数据与文献[3]报道基本一致，故确定化合物1为密蒙花苷C(mimengoside C)。

化合物2 黄色粉末(甲醇);1H NMR(600 MHz，DMSO-d6)δ：7.44(1H，d，J=15.6 Hz，H-7′)，7.03(1H，s，H-2′)，6.94(1H，d，J=8.4 Hz，H-6′)，6.73(1H，d，J=8.4 Hz，H-5′)，6.59(1H，s，H-2)，6.58(1H，s，H-5)，6.45(1H，d，J=7.8 Hz，H-6)，6.27(1H，d，J=15.6 Hz，H-8′)，5.09(1H，s，Rha-H-1′′′)，4.27(1H，d，J=8.4 Hz，Glc-H-1″)，2.66(2H，m，H-7)，1.08(3H，d，J=6.0 Hz，Rha-H-6′′′)；13C NMR(150 MHz，DMSO-d6)δ：129.6(C-1)，116.3(C-2)，144.0(C-3)，145.4(C-4)，115.9(C-5)，120.0(C-6)，35.6(C-7)，70.7(C-8)，125.9(C-1′)，115.3(C-2′)，145.1(C-3′)，148.8(C-4′)，116.7(C-5′)，121.9(C-6′)，146.0(C-7′)，114.3(C-8′)，166.9(C=O)，103.0(C-1″)，74.5(C-2″)，81.3(C-3″)，68.9(C-4″)，74.1(C-5″)，63.9(C-6″)，101.0(C-1′′′)，71.0(C-2′′′)，71.0(C-3′′′)，72.5(C-4′′′)，68.5(C-5′′′)，18.3(C-6′′′)。以上数据与文献[4]报道一致，故鉴定化合物2为异毛蕊花糖苷(isoacteoside)。

化合物3 黄色粉末(甲醇);1H NMR(600 MHz，DMSO-d6)δ：7.44(1H，d，J=15.6 Hz，H-7′)，7.01(1H，s，H-2′)，6.96(1H，d，J=8.4 Hz，H-6′)，6.75(1H，d，J=7.8 Hz，H-5′)，6.61(1H，s，H-2)，6.48(1H，d，J=7.8 Hz，H-6)，6.18(1H，d，J=16.2 Hz，H-8′)，5.02(1H，s，rha-H-1′′′)，4.35(1H，d，J=7.8 Hz，glc-H-1″)，2.68(2H，m，H-7)，0.94(3H，d，J=6.0 Hz，rha-H-6′′′)；13C NMR(150 MHz，DMSO-d6)δ：129.6(C-1)，116.2(C-2)，144.0(C-3)，145.4(C-4)，115.9(C-5)，120.0(C-6)，35.4(C-7)，70.7(C-8)，125.9(C-1′)，115.1(C-2′)，146.0(C-3′)，140(C-4′)，116.7(C-5′)，121.9(C-6′)，148.9(C-7′)，114.0(C-8′)，166.1(C=O)，102.7(C-1″)，74.9(C-2″)，79.5(C-3″)，69.6(C-4″)，74.9(C-5″)，61.2(C-6″)，101.7(C-1′′′)，70.8(C-2′′′)，71.0(C-3′′′)，72.1(C-4′′′)，69.2(C-5′′′)，18.6(C-6′′′)。以上数据与文献[5]报道一致，故鉴定化合物3为毛蕊花糖苷(acteoside)。

化合物4 白色粉末(甲醇);1H NMR(600 MHz，DMSO-d6)δ：7.43(1H，s，H-6)，7.41(1H，s，H-2)，6.96(1H，d，J=8.4 Hz，H-2′，6′)，6.82(1H，d，J=7.8 Hz，H-5)，6.63(1H，d，J=8.4 Hz，H-3′，5′)，3.78(3H，s，H-OCH3)，3.50(2H，t，H-7′)，2.55(2H，t，H-8′)；13C NMR(150 MHz，DMSO-d6)δ：122.1(C-1)，113.1(C-2)，147.6(C-3)，151.5(C-4)，115.4(C-5)，123.9(C-6)，167.7(C-7)，56.0(3-OCH3)，130.09(C-1′)，129.9(C-2′)，115.4(C-3′)，155.9(C-4′)，115.4(C-5′)，129.9(C-6′)，63.0(C-7′)，39.7(C-8′)。以上数据与文献[6]报道一致，故鉴定化合物4为4′-hydroxyphenyl ethyl vanillate。

化合物5 白色粉末(甲醇);1H NMR(400 MHz，CD3OD)δ：7.59(2H，m，H-2′，6′)，6.83(1H，d，J=8.8 Hz，H-5′)，6.24(1H，brd，J=6.4 Hz，H-3)，5.53(1H，d，J=1.6 Hz，H-1)，5.02(2H，m，H-4，6)，4.68(1H，d，J=8.0 Hz，H-1-glc)，3.90(3H，s，-OCH3)，3.00(1H，brd，J=8.8 Hz，H-5)，2.62(1H，brd，J=14.4 Hz，H-9)，2.29(1H，dd，J=14.0，6.0 Hz，H-7-a)，2.06(1H，dd，J=14.0，3.6 Hz，H-7-b)，1.42(3H，s，H-10)；13C NMR(100 MHz，CD3OD)δ：93.5(C-1)，141.2(C-3)，104.7(C-4)，39.6(C-5)，80.8(C-6)，47.9(C-7)，79.3(C-8)，51.8(C-9)，26.3(C-10)，125.3(C-1′)，113.8(C-2′)，148.8(C-3′)，153.1(C-4′)，116.0(C-5′)，122.9(C-6′)，168.0(C=O)，56.5(3′-OCH3)，99.5(C-1′′)，74.9(C-2′′)，78.1(C-3′′)，71.8(C-4′′)，78.3(C-5′′)，63.0(C-6′′)。以上数据与文献[7]报道基本一致，确定化合物5为6-O-香草酰筋骨草苷(6-O-vanilloylajugol)。

化合物6 白色粉末(甲醇);1H NMR(400 MHz，CD3OD)δ：6.72(2H，s，H-2，6)，6.66(2H，s，H-2′，6′)，4.87(1H，d，J=7.6 Hz，H-1′′)，4.77(1H，d，J=3.6 Hz，H-7)，4.72(1H，d，J=3.6 Hz，H-7′)，4.29(2H，m，H-9β，9′β)，3.92(2H，m，H-9α，9′α)，3.86(6H，s，3′，5′-OCH3)，3.85(6H，s，3，5-OCH3)，3.14(2H，brs，H-8，8′)；13C NMR(100 MHz，CD3OD)δ：133.2(C-1)，104.6(C-2，6)，149.4(C-3，5)，136.3(C-4)，87.3(C-7)，55.6(C-8)，72.9(C-9)，135.7(C-1′)，104.9(C-2′，6′)，139.6(C-4′)，154.5(C-3′，5′)，87.7(C-7′)，55.8(C-8′)，73.0(C-9′)，57.2(-OCH3×2，OCH3-3，5)，56.9(-OCH3×2，OCH3-3′，5′)，105.4(C-1′′)，75.8(C-2′′)，77.9(C-3′′)，71.4(C-4′′)，78.4(C-5′′)，62.7(C-6′′)。以上数据与文献[8]报道基本一致，故确定化合物6为syringaresinol-4′-O-β-D-glucopyranoside。

化合物7 白色粉末(甲醇);1H NMR(600 MHz，CD3OD)δ：6.75(2H，s，H-2，6)，6.54(1H，d，J=15.6 Hz，H-7)，6.33(1H，dt，J=16.2，5.4 Hz，H-8)，4.22(2H，d，J=5.4Hz，H-9)，3.85(6H，s，-OCH3)，4.87(1H，d，J=7.8 Hz，H-1′);13C NMR(150 MHz，CD3OD)δ：130.1(C-1)，105.5(C-2，6)，154.4(C-3，5)，136.0(C-4)，135.3(C-7)，131.4(C-8)，63.7(C-9)，57.1(-OCH3×2，OCH3-3′，5′)，105.4(C-1′)，75.8(C-2′)，78.5(C-3′)，71.4(C-4′)，77.9(C-5′)，62.7(C-6′)。以上数据与文献报道[9，10]基本一致，故确定化合物7为刺五加苷B(eleutheroside B)。

化合物8 白色粉末(甲醇);1H NMR(600 MHz，CD3OD)δ：7.10(1H，d，J=8.4 Hz，H-5)，7.07(1H，d，J=1.8 Hz，H-2)，6.95(1H，dd，J=8.4，1.2 Hz，H-6)，6.54(1H，d，J=16.2 Hz，H-7)，6.28(1H，dt，J=15.6，6.0 Hz，H-8)，4.21(2H，d，J=6.0 Hz，H-9)，3.87(3H，s，-OCH3);13C NMR(150 MHz，CD3OD)δ：133.7(C-1)，111.4(C-2)，151.0(C-3)，147.7(C-4)，118.0(C-5)，120.8(C-6)，131.4(C-7)，129.0(C-8)，63.8(C-9)，56.8(3-OCH3)，102.8(C-1′)，74.9(C-2′)，77.9(C-3′)，71.4(C-4′)，78.3(C-5′)，62.6(C-6′)。以上数据与文献[11]报道基本一致，确定化合物8为松柏苷(coniferin)。

化合物9 白色粉末(甲醇);1H NMR(600 MHz，CD3OD)δ：5.60(1H，d，J=10.2 Hz，H-11)，6.42(1H，dd，J=10.8，3.0 Hz，H-12);13C NMR(150 MHz，CD3OD)δ：39.0(C-1)，26.5(C-2)，84.5(C-3)，41.5(C-4)，50.0(C-5)，19.0(C-6)，32.3(C-7)，41.3(C-8)，55.8(C-9)，37.4(C-10)，127.4(C-11)，126.6(C-12)，135.3(C-13)，43.6(C-14)，33.1(C-15)，78.1(C-16)，44.5(C-17)，135.3(C-18)，33.7(C-19)，30.5(C-20)，30.5(C-21)，29.7(C-22)，63.8(C-23)，12.8(C-24)，17.0(C-25)，17.4(C-26)，20.3(C-27)，63.7(C-28)，24.3(C-29)，26.6(C-30)，103.6(C-1′)，76.4(C-2′)，85.7(C-3′)，72.5(C-4′)，71.3(C-5′)，21.0(C-6′)，104.9(C-1″)，76.1(C-2″)，78.4(C-3″)，71.5(C-4″)，78.3(C-5″)，62.5(C-6″)，105.5(C-1′′′)，75.4(C-2′′′)，78.4(C-3′′′)，72.8(C-4′′′)，74.1(C-5′′′)，63.1(C-6′′′)。以上数据与文献[12]报道基本一致，故确定化合物9为醉鱼草皂苷Ⅳb(buddlejasaponin Ⅳb)。

化合物10 白色粉末(甲醇);1H NMR(600 MHz，DMSO-d6)δ：10.00(1H，s，H-4′′′)，7.56(1H，d，J=15.6 Hz，H-β)，7.53(2H，d，J=8.4Hz，H-2′′′，6′′′)，6.78(2H，d，J=8.4 Hz，H-3′′′，C-5′′′)，6.41(1H，dd，J=6.0，1.2Hz，H-3)，6.38(1H，d，J=15.6 Hz，H-α)，5.25(1H，d，J=4.8Hz，H-1)，5.10(1H，d，J=4.2 Hz，H-1′′)，5.05(1H，d，J=6.6 Hz，H-4)，4.58(1H，d，J=7.8 Hz，H-1′)，1.17(3H，d，J=6.0 Hz，H-6′′);13C NMR(150 MHz，DMSO-d6)δ：93.1(C-1)，141.0(C-3)，102.4(C-4)，35.6(C-5)，81.7(C-6)，57.5(C-7)，65.4(C-8)，41.9(C-9)，58.8(C-10)，97.9(C-1′)，74.0(C-2′)，77.5(C-3′)，70.3(C-4′)，76.4(C-5′)，61.4(C-6′)，98.8(C-1′′)，68.2(C-2′′)，73.5(C-3′′)，69.1(C-4′′)，68.9(C-5′′)，17.9(C-6′′)，125.2(C-1′′′)，130.3(C-2′′′)，115.9(C-3′′′)，159.8(C-4′′′)，115.9(C-5′′′)，130.3(C-6′′′)，114.2(C-α)，144.6(C-β)，166.4(C=O)。以上数据与文献[13]报道基本一致，故确定化合物10为6-O-(3″-O-p-coumaroyl-α-L-rhamnopyranosyl)catalpol。

4 化合物活性的筛选

将SH-SY5Y细胞在37 ℃、5% CO2及饱和湿度环境下培养与DMEM培养基(另加胎牛血清、青霉素、链霉素、胰蛋白酶)，待细胞增殖至约80%时铺板，培养细胞按每孔100 μL的密度种植于96孔培养板中。细胞于37 ℃、5%CO2培养箱中培养24 h，将各个样品配制成4个浓度梯度(31、62、125、250 μmol/L)加到96孔培养板中，每个浓度梯度设6个复孔，并设置空白孔(等体积PBS)、正常孔(不含血清的完全培养基)、模型孔(不含血清的完全培养基加入1 mmol/L的MPP+)，作用1 h后加入1 mmol/L MPP+，继续培养24 h后，于每孔中加入20 μL的MTT(5 mg/mL)，继续培养4 h，吸出孔内的培养液，在每孔加入150 μL的DMSO，低速振荡10 min，酶标仪570 nm波长下测定其吸光度(A)值，并计算细胞存活率。

注：与模型组比较：*P<0.05，**P<0.01。

Note:Compared with the model group:*P<0.05,**P<0.01.

通过MTT法对部分化合物给药的细胞存活率进行测定，与模型组相比较(见表1)，所选的4个化合物对MPP+损伤的SH-SY5Y细胞均具有一定的保护作用。其中化合物1和5给药的细胞存活率随着给药浓度的增大而增大；化合物6和7给药的细胞存活率先随着给药浓度的增高而增大，药物浓度达到一定浓度后，细胞存活率达到最大，进一步增大给药浓度，细胞存活率会有所下降。

5 结论

本研究从醉鱼草果实水部位分离纯化得到密蒙花苷C(1)、异毛蕊花糖苷(2)、毛蕊花糖苷(3)、4′-hydroxyphenyl ethyl vanillate(4)、6-O-香草酰筋骨草苷(5)、syringaresinol-4′-O-β-D-glucopyranoside(6)、刺五加苷B(7)、松柏苷(8)、醉鱼草皂苷Ⅳb(9)、6-O-(3"-O-p-coumaroyl-α-L-rhamnopyranosyl)catalpol(10)等10个化合物，其中化合物4、6、7、8和10为首次从醉鱼草属植物中分离得到，化合物2和3为首次从醉鱼草果实中分离得到；利用MPP+诱导的SH-SY5Y细胞模型对化合物1、5、6和7的神经保护作用进行考察，结果显示四个化合物均能使细胞存活率显著提高。本研究进一步丰富了醉鱼草果实中化学成分类型，为更好的开发利用醉鱼草资源提供参考。