声动力治疗在动脉粥样硬化中的应用进展

谢茜，赵云，刘蓉

动脉粥样硬化是一种因脂质代谢和免疫应答障碍引起的慢性炎症性血管疾病。动脉粥样硬化斑块的积累使动脉管腔狭窄、闭塞，从而导致缺血性血管疾病，如冠心病、周围血管疾病、脑动脉疾病等［1］。目前，针对动脉粥样硬化的治疗方式主要有控制饮食、适当的运动、戒烟限酒等综合治疗；降脂、抗血小板聚集、扩张血管、溶栓、抗凝等药物治疗；重建、搭桥等外科介入手术治疗［2］。这些治疗方法在临床上均取得了一定的治疗效果，但存在治疗周期长，不良反应大，且具有侵入性的问题。研究显示，他汀类降脂药物可明显改善冠心病患者的生存期，但其扩血管作用较小，且这种药物最低需要几个月才能达到动脉边缘水平的斑块逆转；经皮冠状动脉介入治疗可迅速扩大管腔并进行血管重建，改善心肌缺血症状，但容易导致冠状动脉痉挛、支架内血栓和再狭窄等并发症［3］。新型治疗方法——声动力治疗（sonodynamic therapy，SDT）可抑制动脉粥样硬化斑块的进展，具有安全、局部治疗对正常的组织影响较小、组织穿透能力强且能量无明显衰减等优点。本研究就SDT对动脉粥样硬化的作用及其机制进行综述。

1 声动力治疗与声敏剂

SDT是一种依靠低强度超声和声敏剂协同作用产生活性氧（reactive oxygen species，ROS）的新型无创治疗方法。声敏剂可优先特异性聚集在病变组织，聚焦超声可激活声敏剂在局部产生ROS，从而进行氧化损伤，达到较高的治疗效果。SDT是在光动力疗法的基础上由日本学者Yumita等［4］提出的一种新的非侵入性的疾病治疗方法。SDT与光动力疗法的最大不同是超声波可穿透人体深部组织，对需要治疗的特定病理部位的作用更集中［5］。SDT最初运用于实体肿瘤，早在1989年Yumita等［4］就发现声敏剂血卟啉介导的超声治疗提高了超声对小鼠肉瘤180和腹水肝癌130细胞的敏感性，杀伤了更多的肿瘤细胞，由此提出了声动力治疗。Arakawa等［6］研究显示，SDT在兔髂动脉支架模型中有抑制内膜增生的作用。目前，SDT已被证实可引起细胞凋亡和自噬，具有改善脂质沉积、减少炎性细胞浸润、促进血管平滑肌细胞再增殖、防止基质降解等作用。

声敏剂按其生物学功能和化学结构主要分成五大类：卟啉类化合物、黄原酮类化合物、抗肿瘤药物、非甾体类抗炎药和其他类型（二氢卟吩、新型纳米分子和亚甲蓝等）的声敏剂。大多数声敏剂已被研究用于现代肿瘤的治疗，然而评估其在动脉粥样硬化的潜在效果研究主要集中在原卟啉IX（protoporphyrin IX,PpIX）和5-氨基乙酰丙酸（5-aminolevulinic acid，5-ALA），这两种声敏剂可以选择性地聚集在动脉斑块中，斑块中的浓度大约是正常血管壁的10～12倍，在体内和体外实验均被证实具有良好的肿瘤治疗效果［7］。值得注意的是，近几年从中草药提取物中发现的某些化合物如羟色胺黄A（ hydroxysafflor yellow A、HSYA）、金 丝 桃 素（hypericin,HY）也具有强大的声动力学活性，且治疗过程中少见由声敏剂所引起的光敏性皮炎［8］。

2 细胞凋亡与细胞自噬

细胞凋亡的过程主要有外源性和内源性两种通路：（1）外源性的死亡受体通路。死亡受体包括肿瘤坏死因子受体和神经生长因子超家族，主要有Fas、Apo-1、TRAM受体等。以Fas受体为例，当Fas受体与Fas配体结合后，导致Fas受体胞质区域内死亡结构域结合Fas结合蛋白（Fas-associated with death domain protein,FADD），FADD再以其氨基端的死亡效应结构域结合半胱天冬酶-8（cystein aspartic acid specific protease，caspase-8）前体，形成由 Fas-FADD-caspase-8前体组成的死亡片段复合物，激活caspase-8，活化的caspase-8再进一步激活caspase-3、caspase-6、caspase-7等后续一系列反应，导致细胞凋亡［10］。（2）内源性的线粒体通路。线粒体是有核细胞能量产生与代谢的主要部位，而高能磷酸化合物可作为一种信号调节细胞凋亡，促进细胞有效吞噬。许多凋亡基因（如bcl-2家族）都位于线粒体膜上，凋亡基因与线粒体膜结合导致线粒体释放细胞色素 C（cytochrome C，cytC），cytC 进入胞浆，与caspase-9的前体结合，激活caspase-9，活化的caspase-9进一步引起后续级联反应，导致细胞凋亡［11］。

2.2细胞自噬 细胞自噬通常被认为是机体一种重要的防御和保护机制，细胞降解非必需的、衰老的或者无功能的蛋白质或细胞中细胞质和细胞器，并回收这些降解的成分以维持正常的细胞内环境平衡。最近研究表明，自噬在调节动脉粥样硬化形成和增强动脉粥样硬化斑块稳定性方面发挥着关键作用［12］。自噬可以选择性地清除动脉粥样硬化斑块中的巨噬细胞，降解脂质，在晚期动脉粥样硬化中，巨噬细胞自噬可以减少炎症反应［13］。

细胞自噬的形成过程为细胞胞浆形成双层膜的囊泡，囊泡包裹细胞质或细胞器形成自噬体，自噬体逐渐变成单层膜后与溶酶体结合形成自噬溶酶体，然后溶酶体中多种不同的酶降解细胞质或者细胞器形成氨基酸和核苷酸，为细胞的生命活动提供能量。目前，双层膜的囊泡来源并不清楚，有可能来自于粗面内质网、高尔基体，也有可能是细胞自身合成。其中许多ATG相关基因参与自噬的调节，Atg复合蛋白和微管相关蛋白质轻链3（microtubule-associated protein light chain 3，LC3）泛素化有着重要的地位，Atg复合蛋白与外膜结合，可促进自噬体形状的改变，同时微管相关蛋白质1轻链3（microtubuleassociated protein 1 light chain 3，LC3-Ⅰ）蛋白被泛素化形成微管相关蛋白质2轻链3（microtubule-associated protein 2 light chain 3，LC3-Ⅱ），定位于膜上，因此，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ可以用来衡量自噬水平的高低［14］。

3 声动力治疗与细胞凋亡和细胞自噬

声动力治疗的基本机制理念有空化效应、自由基理论、ROS生成、细胞凋亡及细胞自噬。超声激活声敏剂产生ROS，是SDT发挥作用的主要机制之一。ROS不仅在肿瘤治疗中发挥重要作用，在动脉粥样硬化治疗中也至关重要，目前，SDT在组织或细胞中产生ROS有2种可能的假说。第一种是声致发光假说，超声波在水性环境中产生称为空化的现象，空化产生充满气体的气泡，气泡在一定程度上爆裂。空化效应根据超声条件和组织或细胞状态可分为两种类型：稳定空化和惯性空化，前者产生温和的气泡，其中大多数处于连续振动和振荡状态。后者与ROS生成关系更密切，产生的气泡剧烈震荡吸收更多的声能，导致气泡剧烈坍塌，在较小范围内产生极端的物理条件，随后发生一系列化学反应。在此过程中，气泡积累了大量的能量，这些能量经历物理声致光现象以发光，产生的光可以激活声敏剂，在微观水平上诱发声敏剂分子的电子轨道激发，一旦被激发的电子回到基态，释放的电离辐射就可以在靶组织中产生ROS［15］。另一种假说是热解假说，该假说认为当气泡通过惯性空化剧烈坍缩时，局部温度迅速上升至大约9 727℃，导致声敏剂分解产生自由基，自由基与内源性物质进一步反应生成ROS。体内多种抗氧化酶和低分子量抗氧化剂在正常生理条件下清除细胞内过多的ROS，然而，SDT导致ROS浓度较高，不能迅速清除并保留在细胞中，从而使ROS在随后引发多种效应［16］。

Li等［17］通过研究大鼠细胞凋亡与ROS的关系，证实了ROS通过线粒体途径诱导细胞凋亡，且ROS在细胞凋亡中起决定性作用。Yumita等［18］通过多羟基富勒烯研究SDT诱导的细胞凋亡，在SDT处理的细胞中可见DNA片段化和caspase-3活化，证实了SDT产生了细胞凋亡；同时使用活性氧清除剂组氨酸后，显著抑制了caspase-3活化，从而抑制了SDT诱导的细胞凋亡。杨力明等［19］在羟基乙酰化姜黄素介导的SDT中证实，SDT通过细胞凋亡稳定了动脉粥样硬化斑块，且5 mg/L是该声敏剂最佳的治疗浓度。Zhuang等［20］通过甘氨酸脱羧酶诱导肝癌细胞自噬的实验证实，ROS通过激活细胞外调节激酶和c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）途径诱导非经典自噬，且氧化还原依赖的自噬在很大程度上依赖于ROS生成的大小和速率。Han等［12］证实，二氢卟吩介导的SDT通过产生ROS激活自噬，并可抑制巨噬细胞促炎因子的表达。

4 声动力治疗对动脉粥样硬化的作用

4.1SDT介导细胞凋亡在动脉粥样硬化中的作用 动脉粥样硬化由动脉壁中的修饰脂蛋白如氧化的低密度脂蛋白的积累引发。在动脉粥样硬化早期，单核细胞被招募到动脉壁内膜，以应对脂蛋白所造成的损伤，并分化成巨噬细胞，巨噬细胞通过清道夫受体摄取脂蛋白并转化为泡沫细胞，帮助脂蛋白停留在动脉壁上。在动脉粥样硬化的发展过程中，泡沫细胞内脂质不断积累，导致慢性内质网应激，使泡沫细胞坏死，同时巨噬细胞分泌促炎因子，引起炎症反应［21］。由于晚期粥样硬化斑块的吞噬功能缺陷，坏死的泡沫细胞不能有效地通过胞吐作用被清除，泡沫细胞内胆固醇被释放在斑块中，从而进一步导致炎症反应的发生［22］。Wang等［23］通过用5-ALA介导的SDT处理西药喂养的apoE-/-小鼠，分别于治疗后第1、3、7、28天处死小鼠，结果表明5-ALA介导的SDT可导致泡沫细胞通过线粒体途径凋亡，显著降低晚期斑块的内质网应激，减轻了炎症反应，且第28天处死的小鼠的炎症反应最轻，表明5-ALA介导的SDT具有一定的时间依赖性；另外，斑块中Mer酪氨酸激酶（Mer酪氨酸激酶对凋亡细胞的吞噬和有效清除至关重要）阳性的巨噬细胞显著增多，表明5-ALA介导的SDT提高了巨噬细胞的吞噬能力。Sun等［24］在动脉硬化晚期的兔和载脂蛋白缺乏的小鼠模型中发现，5-ALA介导的SDT诱导了细胞凋亡，且多数凋亡细胞表达出巨噬细胞标记物CD68（一种细胞浆糖蛋白），表明SDT在体内诱导了有缺陷的巨噬细胞凋亡，并在治疗后的第3天可见斑块中出现更多有胞吐功能的单核细胞，作用是清除凋亡的巨噬细胞，同时可见促炎因子的减少及抗炎因子的增加，表明SDT改善了动脉粥样硬化斑块的炎症环境。基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMPs）主要由巨噬细胞产生，可降解细胞外基质（extracellular matrix，ECM），导致纤维帽变薄，进一步引起斑块的破裂和血栓的形成，在动脉粥样硬化斑块失稳的进展中发挥关键作用，同时MMPs可裂解凋亡受体，抑制细胞凋亡。因此，MMPs可能是治疗动脉粥样硬化血栓形成和预防急性心血管事件的治疗靶点［25］。Li等［26］在兔的动脉粥样斑块模型中，通过5-ALA介导的SDT有效诱导动脉粥样硬化巨噬细胞的凋亡，抑制了MMPs的产生，稳定了粥样斑块；且观察到超声强度1.5 W/cm2、频率1.0 MHz，持续时间15 min、5-ALA的浓度为60 mg/kg时，5-ALA介导的SDT对粥样硬化斑块中巨噬细胞的清除能力最强。

4.2SDT介导细胞自噬在动脉粥样硬化中的作用 动脉粥样硬化斑块中容易破坏的斑块称为易损斑，易损斑的特点是有大量脂质核心，薄纤维帽、血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cell，VSMCs）和胶原蛋白较少，巨噬细胞密度高，ECM合成和降解不平衡。VSMCs在正常血管中表现出分化表型，在斑块形成过程中，它们摄取脂质转化为去分化表型，最终转化为病灶内的泡沫细胞。VSMCs诱导的自噬可以阻止氧化的低密度脂蛋白触发VSMCs来源的泡沫细胞形成，使VSMCs表现出分化表型；反之，缺乏VSMCs自噬可以改变钙离子平衡而影响血管的收缩能力，因此，VSMCs的分化和自噬在动脉粥样硬化的发生、发展过程中发挥重要作用，可能是动脉粥样硬化的治疗靶点。Li等［27］通过评价PpIX介导的SDT对VSMCs的活力和自噬的影响观察到，SDT没有引起VSMCs细胞凋亡；同时，SDT增加了LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值，并显著增加了自噬体形成；PpIX-SDT可增加VSMCs的自噬，但不诱导线粒体依赖性细胞凋亡，稳定了粥样斑块。在正常情况下，氧化的低密度脂蛋白在巨噬细胞中可以自发触发自噬，调节脂质代谢，然而，低水平的自噬很难逆转巨噬细胞内的脂质积累，且脂质可导致溶酶体功能障碍，进而导致自噬缺陷［28］。另有研究显示，SDT可诱导巨噬细胞自噬活性达到有效水平，通过自噬调节细胞内脂质代谢来阻止斑块进展［29］。

HSYA是红花植物亲水性成分的主要组成部分，是一种静脉注射治疗心血管疾病的中药，水溶性好，安全性高。Jiang等［30］认为HSYA可以作为声敏剂，联合超声通过促进ROS生成，诱导人急性单核细胞白血病细胞株（THP-1）巨噬细胞自噬，同时上调ATP结合转运体蛋白A1（ATP-binding cassette transporter A1，ABCA1；一种胆固醇流出调节蛋白）表达，促进巨噬细胞和巨噬细胞源性泡沫细胞的胆固醇外溢，抑制炎症反应。Li等［31］通过研究中药提取物金丝桃素（hypericin，HY）在THP-1巨噬细胞中诱导自噬的潜在机制显示，HY介导的SDT通过调节ROS依赖的细胞转录调控因子EB（trancription factor EB，TFEB；一种自噬激活剂）核易位，诱导巨噬细胞自噬和溶酶体再生，促进脂质的降解，且TFEB的易位在SDT的2 h达到最强。因此，有些中药提取物介导的SDT可诱导ROS产生自噬和溶酶体再生，有效降低脂质含量，抑制炎症反应的发生。

5 问题与展望

SDT作为一种新的治疗技术，已被证实具有改善脂质沉积、减少炎性细胞浸润、促进血管平滑肌细胞分化、防止基质降解等作用，这些作用共同发挥抗动脉粥样硬化的作用。然而，SDT在动脉粥样硬化斑块中的作用是复杂的，对实验员的操作要求高，同时声敏剂种类和浓度、超声参数（频率、强度和持续时间等）及治疗时间等有待进一步研究，但目前SDT多处于临床试验阶段，相信在不久的将来，声动力治疗将用于临床，有望成为一种新的治疗方法。