HbSNP12基因及HbCBF1基因在巴西橡胶树中的差异分析

毛常丽，张凤良，李小琴，杨 湉，倪书邦，吴 裕

（云南省热带作物科学研究所，云南景洪666100）

单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。SNP技术已被广泛应用于基因分型、分子系统学和谱系地理学的研究，其能真实的反映基因组DNA上的遗传信息，进而比较全面地揭示基因组的复杂性和多样性，因此在生命科学研究中扮演了十分重要的角色。

橡胶树的规模化种植和天然橡胶生产已取得了长足的发展，橡胶树种质资源的收集、保存和研究成为天然橡胶生产国的重要任务。在橡胶树研究中，现已克隆得到与橡胶合成有关的蛋白和酶基因，如HMG-CoA还原酶基因、FPS基因、REF 基因、SRPP 基因等。W.Pootakham［1］等 用高通量454测序仪对橡胶树的5883个假定位点进行测序，最终得到10条较好的SNP标记（已在NCBI登记），但如何用这些标记对橡胶树种质资源进行评价还未见报道。本研究以NCBI报道的橡胶树HbCBF1、HbSNP12基因序列为基础设计特异引物，利用PCR及测序技术，选择抗寒性较强和较弱的两组橡胶树为材料，对其在抗性相对的两组材料中的碱基差异进行分析，为选择适用于橡胶树种质资源评价的SNP标记引物奠定基础。

1 材料和方法

1.1 材料

实验用的橡胶树叶片采自于农业部景洪橡胶树种质资源圃。将抗寒性强和抗寒性弱的两组橡胶树变色期叶片采集后于变色硅胶干燥保存。本研究的实验材料信息见表1。

表1 用于扩增HbSNP12、HbCBF1基因的橡胶树种质资源信息

1.2 方法

选择NCBI中已经登记的橡胶树HbCBF1（GI:66269670）及HbSNP12（GI:363901081）基因序列，用Primer Premier 5.0设计特异引物。用Trizol法提取材料RNA后进行反转录，得到DNA第一链，再对所选材料的HbCBF1及HbSNP12两基因进行PCR扩增及测序后，用ClustalW软件比对两组实验材料得到的碱基序列差异性，如有差异，将碱基序列翻译为氨基酸序列，探明是否在氨基酸序列上存在差异。

1.2.1 引物设计

PCR引物根据在NCBI中已经有报道的橡胶树HbCBF1、HbSNP12基因序列的保守区域设计，引物设计软件为Primer Premier 5.0。设计的特异引物如下:

HbCBF1基因上游引物:ATGGATGTTTTCYCTCAMTWYCTG；下游引物:TYATATWGAAAARCTCCAKAAWGACA（700 bp）。

HbSNP12基因上游引物:GTTGATCCTGAAGGAAAGGGC；下游引物:CAACACCCTGTCAACCAAGTTG （756 bp）。

1.2.2 RNA提取、cDNA第一链合成及PCR反应

采 用 Trizol法 提 取 RNA。 用 TaKa-Ra RNA PCR Kit（AMV）Ver.3.0试剂盒进行反转录得到cDNA，以cDNA为模板进行PCR扩增，扩增体系为 25 mL:10×Dream Taq Buffer 2 μL，dNTP（25 mM）0.5 μL，dNTP Mixture（各2.5 mM）2.5 μL，上游引物（10 μM）1 μL，下游引物（10 μM）1 μL，TaKaRa Taq（5 U/μL）0.2 μL，反转录产物 1 μL，灭 菌 蒸 馏 水 16.8 μL，PCR 程 序:94℃ ，预 变 性5 min；94℃ 变 性 30 s，57℃ 退 火 30 s，72℃ 延 伸45 s，32个循环；72℃延伸 7 min。PCR 产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.2.3 PCR产物的纯化

将上述PCR产物中700 bp左右的条带割胶，使用北京百泰克生物技术公司生产的凝胶回收试剂盒过柱回收。回收程序依据试剂盒提供方法进行。

1.2.4 测序及序列分析

将纯化好的产物送上海生工生物技术公司进行测序后，在NCBI数据库中进行BLAST搜索，确定所测的序列为HbCBF1、HbSNP12基因。序列采用DNAStar、ClustalW等软件进行分析。

2 结果与分析

2.1 RNA提取效果

用Trizol法提取以上材料的RNA。提取RNA后，1.5%琼脂糖，1×TAE电泳缓冲液，紫外透射光下观察并拍照，效果如图1。

2.2 PCR结果

将所有材料RNA反转录后用所设计的两对引物进行PCR扩增，扩增后的琼脂糖电泳效果如图2。从图中可以看出，在700 bp左右有一条很亮的条带，将该条带纯化后进行测序，所测得的序列Blast比对后，确定为HbSNP12、HbCBF1两基因序列。

2.3 橡 胶 树 HbCBF1、Hb-SNP12基因序列测序结果

将纯化后的产物进行测序，并对序列进行分析，得到Hb-SNP12及HbCBF1基因序列长度分别为700 bp、756 bp。

HbSNP12基因在抗寒性差异较大的10份橡胶树种质中，抗寒性相差较大的两组材料在105 bp、538 bp处分别为A/T及A/C间的颠换，将碱基序列转换为氨基酸序列后进行比对，得到同样的结果，即在35位氨基酸处抗寒性强的种质为组氨酸，抗寒性弱的种质为谷氨酰胺，180位氨基酸处抗寒性强的种质为苏氨酸，抗寒性弱的种质为脯氨酸。

HbCBF1基因在抗寒性差异较大的10份橡胶树种质中，抗寒性相差较大的两组材料在92 bp、387 bp处分别为A/C间的颠换及A/G间的转换，将碱基序列转换为氨基酸序列后进行比对，得到结果为:在31位氨基酸处抗寒性强的种质为苏氨酸，抗寒性弱的种质为天冬氨酸，在129位氨基酸处抗寒性强的种质为丙氨酸，抗寒性弱的种质为甘氨酸。

3 讨论

我国推广种植的橡胶树遗传基础狭窄，即使是在表型上存在差异，但其遗传变异依然很小［2］。一直以来，橡胶树育种工作者致力于提高橡胶树的抗寒性，以扩大橡胶树种植面积，但多集中在传统的新品种选育及区域性试种上，用分子生物学手段开展抗寒性选择的很少。程汉等克隆了橡胶树抗寒性相关的基因—HbCBF1基因［3］，为橡胶树抗寒性的分子筛选奠定了基础。

关于CBF1基因，在山葡萄中已经克隆并对其功能进行了分析，证实与抗寒性相关［4］，将茶树中的CBF1基因克隆到烟草中，证实其与抗寒性相关［5］；NCBI中报道了橡胶树HbSNP12基因，该基因经BLAST后，和甜橙、蓖麻、白杨的S-腺苷甲硫氨酸脱酸酶基因（SAMC）的序列一致度达到100%，在小麦水分胁迫［6］、抗旱节水［7］，甘蔗抗寒、抗旱［8］，棉花抗寒性［9］等多种生物代谢中均有研究，其在生物体所有细胞的代谢中均起重要作用，参与了体内100多种不同的甲基转移酶催化反应。从本研究结果可以看出，虽然选择的实验材料为抗性相差较大的种质，但是测得的碱基变异很小，只存在两个碱基的差异，将碱基序列翻译成氨基酸序列进行比对，同样得到的是抗性相差大的种质，其氨基酸发生了变化，该结果为橡胶树的SNP标记筛选提供依据，为橡胶树抗寒性的早期筛选奠定基础。

本研究发现，在橡胶树中存在少量的多态性位点，而且在参试的两组有抗性差异种质中存在差异，但这种差异是否是引起表型变异的真正原因，还需要后续实验进行验证。