TDG介导的去甲基化在细胞发育分化 及肿瘤发生中的研究进展

郁霞青， 宋影春 综述， 李 丹 审校

(同济大学附属第十人民医院核医学科，上海 200072)

DNA甲基化与去甲基化的平衡在个体的整个生长发育过程中起到重要的调节作用，并且受到严密的调控。胸腺嘧啶DNA糖苷酶(thymine DNA glycosylase, TDG)是近几年研究发现的一个调节DNA甲基化的酶，属于尿嘧啶DNA糖苷酶(uracil-DNA glycosylase)超级家族，在调控DNA甲基化动态平衡中，特别是DNA主动去甲基化中，发挥了重要作用。本文对TDG调控DNA去甲基化的机制及其在生命发生发展与疾病发生中的作用进行综述，为进一步了解TDG在生理和病理过程中的作用提供理论依据。

1 TDG在DNA甲基化修饰调节中发挥多方面的作用

1.1 DNA的甲基化修饰

DNA甲基化是最早被发现的DNA表观遗传修饰途径之一[1]。在胚胎发育、配子发生和体细胞组织分化等过程中，建立和维持正确的DNA甲基化模式是必不可少的[2]。在本综述中，对于DNA甲基化修饰特指胞嘧啶被修饰成5-甲基胞嘧啶(5-methylcyosine, 5mC)。

1.2 TDG介导的DNA去甲基化

TDG参与的DNA去甲基化修饰包含两种类型: DNA被动去甲基化和DNA主动去甲基化。

1.2.1 TDG与DNA被动去甲基化 DNA的甲基化的发生和传递依赖DNA甲基转移酶(DNA methylation transferase, DNMT)驱动，如果DNMT的活性受到抑制，会阻碍新的甲基化修饰发生。TDG通过靶向锚定DNMT，抑制DNMT对DNA产生新的甲基化修饰[2-3]，已携带修饰基团的DNA被不断地“稀释”，总体的DNA的甲基化率则会随着复制的进行而不断减低，这被称为TDG介导的DNA被动去甲基化。

1.2.2 TDG与DNA主动去甲基化 DNA被动去甲基化只能阻断新的甲基化事件的发生，若是需要通过不依赖DNA复制的方式将已被修饰的DNA甲基化基团完全去除，则需要通过DNA主动去甲基化过程实现。TDG介导的DNA主动去甲基化的机制主要是对5mC氧化或脱氨基后产生的异常碱基进行碱基切除修复(base excision repair, BER)，最终达到将5mC: G修复成未经修饰的C: G的目的[4]。将5mC进行氧化或脱氨基需要其他蛋白协助，包括DNA羟甲基化酶10-11转位(ten-eleven translocation, TET)蛋白家族、活化诱导胞苷脱氨酶(activation-induced cytidine deaminase, AID)和载脂蛋白B mRNA编辑酶催化多肽(apolipoprotein-B mRNA-editing enzyme catalytic polypeptide, APOBEC)蛋白家族、生长阻滞和DNA损伤诱导蛋白45(growth arrest and DNA damage-inducible protein 45, Gadd45)、DNMT等。

TET蛋白家族是最主要的与TDG协同作用参与DNA主动去甲基化的蛋白，该蛋白家族中的TET1、TET2和TET3均可对5mC进行氧化，将其逐步变成5-羟甲基胞嘧啶(5-hydroxymethylcytosine，5hmC)、5-醛基胞嘧啶(5-formylcytosine，5fC)和5-羧基胞嘧啶(5-carboxylcytosine，5caC)[5]。研究表明，TET1和TDG在物理上相互结合，能够有效地进行DNA去甲基化修饰[6]。5hmC是DNA主动去甲基化的重要中间产物，在哺乳动物细胞中有广泛累积[7]。5fC是5hmC的氧化产物，TDG对5fC显示出较高的亲和力[8]。5caC是5fC进一步的氧化产物，TDG通过不同的机制切除5fC和5caC，并恢复未修饰的G: C配对[9]。

另一种主动去甲基化的方式是5mC脱氨基后的切除修复。5mC可直接被AID/APOBEC脱氨基至胸腺嘧啶[10]，或者也可在被氧化成5hmC后被AID/APOBEC脱氨基至5-羟甲基尿嘧啶(5hmU)[11]，随后TDG通过BER过程进行修复。有研究证明AID、Gadd45a、TDG互相结合成一个复合体共同发挥作用[4]。Gadd45a与Gadd45b均是Gadd45蛋白家族的成员，在胚胎干细胞中具有相似的表达水平。Gadd45a(或Gadd45b)可以通过促进TDG介导的DNA主动去甲基化修饰，消除5fC和5caC的积累[12]。此外，有研究显示，从头甲基化的过程也是一个可逆的过程，在缺失甲基供体S-腺苷基甲硫氨酸的情况下，DNMT3a和DNMT3b亦能将5mC脱氨基成胸腺嘧啶[13]，从而实现去甲基化。其中，DNMT3a的PWWP结构域和催化结构域能与TDG相互作用，对TDG的糖基化酶活性进行正向调节[3]。

1.3 TDG与DNA的稳定性维持

甲基基团在胞嘧啶中的写入和擦除为甲基化修饰建立调节机制提供了可能性，但是这种分子模式也有缺点。5mC可自发脱氨基而产生胸腺嘧啶，导致T: G错配，若不能及时修复，则会在后续复制中导致该位点产生C→T的突变，降低基因组的稳定性。另外，有学者综述了AID带来的体细胞自发突变与DNA修复之间的平衡关系，胞嘧啶可在AID的作用下脱氨基生成尿嘧啶，跨尿嘧啶的DNA复制可导致C→T或G→A的突变[14]，而由5mC羟基化生成的5hmC亦可造成这种跨尿嘧啶复制产生的突变。碱基错配情况的存在使高保真的DNA的自身修复显得尤为重要。尿嘧啶DNA糖苷酶家族是可对DNA中的错配碱基对进行特异性识别修复的一组酶[15]。TDG作为该家族中的重要成员，可通过BER作用修复异常T: G碱基错配[3-4]，亦可将5hmU切除修复为胞嘧啶[11，14]。TDG在消除这种由5mC自发脱氨带来的基因组不稳定问题上发挥了重要的作用。

此外研究发现，当DNA双链中胸腺嘧啶与受损的腺嘌呤残基配对时，TDG可对受损碱基对序列发动异常修复，切除位于受损链对侧的正常链中的胸腺嘧啶，启动异常碱基修复[16]。通过对人单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism, SNP)数据库的生物信息学分析，与全基因组突变谱相比，CpG岛的自发突变谱显示出对TpG→CpG与CpA→CpG突变的强烈突变偏向，TDG催化的BER被认为可能参与维持体内启动子CpG岛中的CG含量，维持CpG岛的完整性[16]。TDG维持启动子区域CpG岛的完整性这一功能，为甲基化修饰调控基因的表达提供了稳定的序列背景。

2 TDG调控的DNA去甲基化修饰在胚胎发育、细胞分化及衰老中的意义

2.1 TDG与胚胎发育

哺乳动物的生殖细胞在大体上具有相似的甲基化模式——配子高甲基化、合子的甲基化修饰被大部分擦除后再重建——生殖细胞从配子形成到受精发育成胚胎的过程中会经历多次必须的去甲基化修饰[1，17]。人类原始生殖细胞的甲基化水平在妊娠后10～11周降至最低点，随后进入重新甲基化过程[18]。去甲基化在胚胎发育过程中的普遍存在提示着其在生命发生中扮演了重要角色。

TDG作为DNA去甲基化的一个关键因子，对于胚胎发育是必不可少的。一项原位杂交实验检测到在小鼠早期胚胎中TDG高度表达于神经系统、胸腺、肺、肝、肾和肠等组织；在晚期小鼠胚胎中TDG高度表达于胸腺、脑、鼻上皮、肠、皮肤、肾、牙齿和骨骼的增殖区域(在肺和肝中较早期胚胎下降)；出生后TDG在大多数组织中均表达下降(除了睾丸)[19]。在两项TDG基因敲除小鼠的研究中，TDG缺失的纯合子小鼠胚胎在发育早期(大约第11.5天)即死亡，且死亡的胚胎表现出内出血及器官发育障碍等异常表型[2，4]。在TDG缺失的死亡胚胎中，胚胎发育和发生相关的基因在缺少TDG的情况下出现严重表达下调(如HOXD13、SFRP2、HOXA10、TWIST2、RARB[2]，以及RAR、RXR、p300[4]等)，可在这些基因的启动子CpG岛检测出高甲基化状态[2]。在胚胎发育过程中，TDG与常染色体紧密结合，保护调控发育基因的启动子CpG岛免受高甲基化修饰，阻止了胚源性疾病的发生。

2.2 TDG与细胞分化

哺乳动物细胞的DNA甲基化模式的擦除重建与细胞重编码后多能性的建立与稳定息息相关[20]。TDG通过介导DNA的主动去甲基化，使基因组发生重编码，重新激活细胞多能性[20-22]。在Hu等[20]的研究中，TDG与TET协同介导DNA去甲基化过程，使得小鼠胚胎成纤维细胞(mouse embryo fibroblasts, MEFs)的基因重新编码，失分化形成多能干细胞(induced pluripotent stem cells, iPSCs)。而TDG缺陷的MEFs会造成间充质向上皮转换的过程被阻断，导致重编码失败。同时去甲基化过程所依赖的microRNA(miRNA)也会因此出现缺失(包括miRNA-200a、miRNA-200b、miRNA-200c、miRNA-141及miRNA-429)，这在某种程度上进一步阻碍了MEFs向iPSCs转化的过程[20]。这证明了TDG在诱导细胞产生多能性的过程中必不可少。

此外，TDG在参与体细胞的生长分化过程中发挥着重要作用。在一项研究中，体外细胞系实验证实TDG可受miRNA-26a的靶向调节，抑制TDG的表达。随后证实了TDG在小鼠出生后胰岛的分化过程中表达下调，且伴随miRNA-26a的上调。通过建立miRNA-26过表达的小鼠，研究者发现miRNA-26a的过表达增加了体内胰腺细胞的数量以及在体外培养时的内分泌细胞与腺泡细胞的比例[21]。这说明了TDG可受miRNA的调控，对体内的细胞的分化增殖产生影响。另有研究显示，miR-29b与TDG存在靶向关系[23]，而miR-29b可以下调DNA去甲基化酶TET蛋白的表达，并显著促进间充质干细胞向成骨细胞的分化[24]，但是TDG在此过程中的作用有待深入研究。此外，TDG可能参与Gadd45b调控的神经系统的生长发育。研究显示，Gadd45b缺失的小鼠在神经祖细胞增殖、成年海马体中新生神经元的树突生长中表现出特异性缺陷[22]。可见TDG介导的DNA去甲基化在建立组织特异性表达的细胞生长分化过程中具有重要作用。

2.3 TDG与衰老

过去的研究表明，人类基因组甲基化模式的变化与生命周期中随着时间进行的老化有关，这种现象通常被定义为“表观遗传漂移”[25]。DNA去甲基化和超甲基化的共同发生构成了哺乳动物衰老过程中DNA甲基化的变化模式[26]。衰老过程中出现广泛的基因组中CpG甲基化修饰的减少。这种去甲基化事件往往发生在整个基因组的重复序列中，因此形成了在全基因组中普遍存在的局面[27]。而除了广泛的全基因组低甲基化外，衰老还涉及显著的DNA甲基化的增加，提示着在衰老情况下存在特定基因的表达沉默[26]。

近年来的研究表明，TDG在哺乳动物衰老状况下表现出局部表达下降的趋势。在欧洲的“MARK-AGE”项目中的一项研究中，衰老群体外周血单核细胞中的TDG、TET1、TET3表达降低，伴随5hmC减少和5caC积累[28]。其中，TDG的下调或者TDG活性的损伤则是5caC积存的原因[29]。另有研究显示，老年小鼠主动脉miRNA-29a的水平与TDG负相关[30]，miRNA-29a可以抑制TDG的表达[30-31]，这提示了衰老状况下机体可能通过miRNA调节TDG的表达而影响甲基化模式。此外，在老化的卵母细胞中，所有DNA去甲基化的标志物发生动态调节。TDG在自然老化的卵母细胞中表达受到抑制，并伴随TET3的增高。在加速老化的状态下，TET3和TDG亦产生同样的变化[32]。因此，TDG的表达降低，以及相关甲基化标志物的动态改变，这些都有可能导致机体在衰老状态下的甲基化模式改变，并很有可能促进衰老状态下疾病的发生。

3 TDG介导的DNA去甲基化与肿瘤发生

TDG与癌症的发生发展具有密切的关系。在许多恶性肿瘤疾病或其疾病模型中可观察到TDG的异常表达，包括食管癌[33]、结直肠癌[34-35]、胰腺癌[36]、多发性骨髓瘤[37]、非黑色素瘤皮肤癌[38]等。其中涉及到的TDG作用机制包括: 杂合错义突变造成酶的功能失活[34-35，38]，TDG的表达抑制受到癌基因Ras的调控[36]，TDG自身高甲基化导致的基因沉默[37]等。

3.1 去甲基化通路失衡引发基因突变

TDG表达失调，在极大程度上会影响DNA去甲基化通路中各个酶之间的平衡作用，对基因组的稳定性及基因表达调控产生负面影响。TDG的缺失或表达下调，会导致去甲基化中间产物的毒性累积、5mC自发脱氨后的突变损伤延续，造成体细胞的G: C→A: T突变，增加对外界损伤因素的敏感性；而TDG对同时存在的去甲基化中间产物和T: G错配的修复效率差异，亦可能在TDG酶失调时造成修复遗漏，影响体细胞基因组的自我修复过程，从而导致肿瘤的形成。

3.1.1 去甲基化中间产物的毒性累积 TDG介导的DNA主动去甲基化涉及到多种蛋白，一旦参与其中的各种酶之间没有保持高度协调，则会导致通路中的上下联系无法达到一个相对平衡的状态。在一项细胞实验中，TDG的敲除会导致TET2参与的DNA主动去甲基化产生的中间产物(包含羟基化产物: 5hmC、5fC、5caC)的累积。这些中间产物的累积会诱导哺乳动物细胞基因组的突变，促使G: C→A: T的转变[39]。因此，TDG的正常表达对于控制TET2的活性表达结果十分重要。在TDG缺少的情况下，去甲基化作用失衡造成的具有基因组毒性的中间产物的累积，将引起体细胞发生突变，降低基因组的稳定性。

3.1.2 自发脱氨后的突变损伤 相比于胞嘧啶自发脱氨基产生尿嘧啶，5mC更容易自发脱氨基产生胸腺嘧啶，产生T: G错配。并且，上文中提及到AID的脱氨基作用可使胞嘧啶脱氨基为尿嘧啶，5hmC亦可脱氨基为5hmU，通过跨尿嘧啶复制而引起突变的发生[14]。因而甲基化状态下的DNA若是缺乏DNA修复酶的保护，十分容易发生内源性突变，导致基因组的不稳定。因此甲基化状态下的碱基错配修复酶的缺失可能加剧基因组的不稳定性。在1例存在TDG杂合错义突变的直肠癌病例中，研究者发现了肿瘤细胞DNA中大量C: G→T: A的突变，而在肿瘤中突变基因的CpG位点大体上在正常结肠黏膜中被甲基化修饰[34]。可推测这些位点的突变可能是由5mC脱氨基化为胸腺嘧啶引起的。TDG的杂合错义突变造成TDG蛋白表达失调，以致G: T错配碱基修复失败，产生大量的C: G→T: A突变的累积与延续。该病例可为TDG错义突变引起5mC自发突变的挽救失败而导致肿瘤的发生提供体内证据。

3.1.3 TDG的修复遗漏 TDG作为尿嘧啶DNA糖苷酶超级家族的成员之一，具备高效的碱基切除修复能力。但是当存在多种影响基因组稳定性的威胁时，其对不同修复对象的修复效率差异会使修复过程存在一定的局限性。有研究显示，当去甲基化中间产物5caC和T: G错配分别存在时，TDG会以高于5caC的效率处理T: G错配。但是，当两者同时存在于邻近的相对位点时，TDG更倾向于修复5caC，两种作用的前后发生可以避免DNA双链断裂(DNA double-strand break, DSB)[6]。但与此同时也有潜在的隐患，5caC的优先修复可能造成T: G错配修复的遗漏，最终导致C: G→T: A突变的固定和延续。这种隐患在TDG功能失调的情况下会恶化，导致基因组的不稳定。

3.2 TDG失调导致肿瘤易感性增加

TDG参与的去甲基化通路失衡会增加基因突变的风险。而基因突变会使细胞对各种损伤因素的敏感性增加，基因的不稳定性可以诱发肿瘤形成。多项研究证明，TDG的基因表达水平下降或TDG蛋白活性下降可能会增加癌症发生的风险。

3.2.1 TDG的表达沉默与肿瘤 TDG不仅参与去甲基化过程，其本身亦受到表观遗传修饰调控。有学者在多发性骨髓瘤细胞系中检测到TDG的表达下调与其启动子区域的高甲基化程度相关[37]。TDG表达水平与细胞在受到过氧化氢损伤时显示出的修复活力具有显著相关性；外源性的TDG表达可以在功能上补偿受损的DNA修复活动。由此看来，高甲基化造成的TDG沉默可能增加细胞对外界损伤因素的敏感性，但是还需更多的研究证明高甲基化引起的TDG下调对肿瘤发生的影响。此外，有研究发现TDG在胰腺癌中表达下降[36]。并且该研究通过体外实验证实癌基因Ras通过抑制转录激活因子生长蛋白抑制剂4(inhibitor of growth protein 4)与TDG的启动子的相互作用，从而下调TDG的表达。综上，不同机制导致的TDG的表达沉默可能增加癌症发生的风险。

3.2.2 TDG的错义突变与肿瘤 TDG的SNP与肿瘤易感性相关。有体外研究表明，表达TDG的G199S变异(SNP: rs4135113)的细胞中会发生无碱基位点的持续积累，从而引发DSB。这将降低基因组的稳定性，诱导细胞的转化[40]。该研究证明了TDG的错义突变增加了基因组对损伤因素的敏感性，进而发生更为严重的DSB结局，造成细胞命运向癌变的方向发展。

此外，临床病例研究为TDG错义突变与肿瘤易感性提供了更多证据。在一项基于人群的DNA修复基因变异的研究中发现，TDG的两种SNP与非黑色素瘤皮肤癌患者再患其他恶性肿瘤的风险之间具有显著相关性: 一种是导致TDG的V367M变异的非同义编码的SNP(rs2888805)，另一种是与rs2888805高度连锁不平衡的SNP(rs4135150)[38]。其中，造成V367M变异的SNP(rs2888805)在一项94例家族性直肠癌的研究中存在10%以上的突变[35]。此外，在直肠癌中还发现了氨基酸的R66G变异、非同义编码氨基酸D284Y变异等[34-35]。另外，尽管不是错义突变，TDG的SNP(rs4135054)被报道与食管鳞状上皮细胞癌显著相关[33]。这些基于肿瘤病例的研究进一步说明了TDG错义突变增加了基因组的不稳定性及肿瘤发生的风险。

4 展 望

TDG通过参与被动与主动去甲基化过程，在建立和维持合理的基因组甲基化模式中发挥了重要作用。在整个生命发生发展的过程中，TDG在各个阶段肩负不同的使命: 在胚胎发育过程中保护了发育相关基因的正常表达，避免了胚源性疾病的发生；调控基因组的重编码、激活细胞的多能性，诱导胚胎成纤维细胞失分化为多能干细胞；参与机体在衰老状况下的基因组甲基化模式调整，调控衰老过程中特定基因的表达与沉默。

此外，TDG的碱基切除修复作用维持着基因组的稳定性，消除了外源性或内源性因素对基因组的损伤，避免基因突变及DNA双链断裂。当TDG表达下降或活性降低时，去甲基化途径中产生的多种损伤因素会影响基因组的稳定性: (1) 影响去甲基化通路中各个酶的协调运作，造成去甲基化中间产物的毒性累积；(2) 高甲基化位点中5mC的自发脱氨基引发DNA突变的累积和延续；(3) TDG对去甲基化中间产物的优先修复造成邻近的其他错配修复遗漏。这些影响基因组稳定性的因素可能与癌症的发生具有密切联系。

目前关于TDG与癌症的研究资料为TDG功能失活而增加肿瘤易感性的风险积累了证据，但是还未能总结出公认的TDG介导的去甲基化作用与癌症之间的关联机制。本综述提出可能的关联机制是: TDG参与的去甲基化通路失调所产生的上述3种损伤因素，将引起基因突变，降低基因组的稳定性，从而增加了肿瘤生成的风险。研究TDG介导的去甲基化与肿瘤生成之间的关联机制，将有助于我们理解表观遗传分子在肿瘤中的相互作用关系，为优化肿瘤的早期诊断指标、开发高效精准的表观遗传调控药物、准确评估肿瘤的预后提供新的策略。