猪精液超低温冷冻保存研究进展

吴 梦，刘雪芹，刘子嘉，肖普英，丁玉春,3,4，刘作华,3,4*，葛良鹏,3,4*

（1.重庆市畜牧科学院，重庆 402460；2.养猪科学重庆市市级重点实验室，重庆 402460；3.农业部养猪科学重点实验室，重庆 402460；4.重庆市医用动物资源开发与转化应用工程技术中心，重庆 402460）

猪的遗传资源保存是实验用猪作为模式动物开发应用的基础性保障。猪精液保存是猪遗传资源保存的重要途径，与卵母细胞、受精卵、胚胎的低温保存相比，精液低温保存技术方便、快捷且更加经济。不仅如此，精液低温冷冻保存在建立动物精液基因库、提高优良种公猪的利用率、开展国际间种质资源交流、防止疾病传播等方面有着重要意义。但与鲜精保存相比，冷冻解冻后的精子活率和生育率较低，极大地限制了猪精液冷冻保存技术的推广应用。本文从猪精液冷冻保存的研究概况、冷冻损伤机理及猪精液冷冻保存影响因素方面的进展进行综述，为猪精液超低温冷冻保存研究提供新的思路和方法。

1 猪精液冷冻保存的研究概况

Polge 等[1]最初采用牛精液冷冻方法来冷冻猪精液，虽然解冻后的精子具有一定活力，但没有受精能力。Polge 等[2]首次采用外科手术法将解冻后的精子直接注入受体母猪输卵管，获得了83%的受精卵。自20 世纪70 年代以后，猪冷冻精液的研究发展较快，陆续有报道利用冻精成功获得存活仔猪。Pursel 等[3]和Westendorf 等[4]分别以颗粒和细管冷冻方法成功保存了猪精液。此后，为了把猪的精液冷冻技术应用到养猪生产实践中人们做出了大量工作，并对操作程序进行了不断优化。20 世纪80 年代初至90 年代末，研究人员主要采用甘油（GLY）作为冷冻保护剂，通过优化GLY 浓度、采用不同剂型和不同冷冻速率等探索提高猪精子冷冻效率的方法[5-8]。随着对精液冷冻机理研究的深入，研究人员开始发现并尝试各种新型精液稀释液，其中研究较多的是低密度脂蛋白（LDL）、双糖（乳糖、蔗糖、乳果糖、海藻糖或蜜二糖）、甲基-β-环糊精载胆固醇（CLC）、谷胱甘肽、过氧化氢酶等，同时配合优化后的冷冻-解冻方法来降低对精子活率和受精率的影响，并取得了一定进展[9-15]。

国内猪精液冷冻保存技术研究起步较晚，于1974年才开始对猪精液冷冻保存技术开展研究，20 世纪80年代开始从国外引进生产冷冻精液的设备和技术。吴石坚等[16]统计了1981—1988 年猪冷冻精液人工授精（AI）的推广与应用，总计配种受体母猪61 481 头，虽然第一情期平均受胎率为75.97%，但产仔率仍然处于较低水平。从20 世纪90 年代开始，许多研究人员从冷冻保护剂、稀释液、冻精剂型、解冻液等多方面进行了研究和优化，取得了一定成绩，但对精子损伤机理、冷冻-解冻机理、冷冻-解冻对精子的影响等诸多方面尚不完全清楚，仍处于实验阶段[17-22]。近年来，由于氧化性损伤对精子损伤机理研究的不断深入，国内外研究者开始转向研究抗氧化剂对猪精液冷冻保存的影响，以期在冷冻-解冻过程中提高精子活率，除了添加谷胱甘肽、过氧化物酶、维生素E 等添加剂外，还采用一些植物性抗氧化剂，例如黄芩素、黄芪多糖、红景天多糖、芝麻酚等，虽然这些抗氧化剂能对猪精子产生不同程度的抗氧化作用，但就目前的研究结果来看，冷冻精液与鲜精相比，在受胎率和窝产仔率方面仍存在较大差距[23-27]，随着对猪精子冷冻因素的深入分析，冷冻对猪精子形态结构、蛋白质和酶活力等冷冻损伤机理研究的不断深入，更多的冷冻保护剂在不断地被开发和应用，因此还需要不断探索，建立高效稳定的猪精液冷冻保存方法，并将其应用于生产实践中，提高种猪繁殖力和猪种资源利用率。

2 猪精液冷冻损伤机理

2.1 物理性损伤 物理性损伤是指精子细胞水分形成的冰晶，其体积增大且形状不规则，由于冰晶的扩展和移动，对精子质膜和细胞内部结构造成机械性损伤，导致细胞死亡。在缓慢降温的条件下，冰晶形成的温度范围为-60～-10℃，-25～-10℃时形成冰晶最多，且降温越缓慢冰晶形成越多，对精子损害越大。因此，在精液冷冻过程中要尽量避开-60～-10℃这个危险温度区，才利于精液长期保存。为了减少或避免发生冰晶化，必须快速降温越过产生冰晶的温度范围，并保存在冰晶不再形成的超低温条件下，如-196℃的液氮或-269℃的液氦[28]。当然，冷冻速率并不是越高越好，如果冷冻速率过高，细胞内水分不会完全流出，在细胞内冻结，而细胞质中冰晶的形成最终导致冷冻损伤。Byrne 等[29]将5℃平衡后精液直接放入液氮蒸汽中，结果显示精子活力明显低于经一定降温速率冷冻的精子。除了冷冻时需要尽量减少冰晶形成外，解冻也同样面临-60～-10℃的危险温度区间，因此，快速解冻同样非常必要。Johnson 等[30]以GLY 为例，在保证冷冻后猪精子的活率和顶体完整性上，得到的最佳冷冻组合：3%的GLY、30℃/min 的降温速率和1 200℃/min 的解冻速率。因此，在猪精液冷冻过程中，无论是降温还是升温都应采取快速处理，且配合适宜浓度的保护剂，以避免危险温度区对精子的损伤。

2.2 化学性损伤 化学性损伤是指不断降温过程中细胞外液首先形成一小部分冰晶，使细胞外液渗透压逐渐增大，而精子细胞内的水分由内向外流出，导致细胞内的溶质浓度和渗透压增高，精子细胞严重脱水发生不可逆的化学性损伤而死亡。研究表明，在精液稀释液中添加一定浓度的GLY、二甲基亚砜（DMSO）、二甲基甲酰胺（DMF）等抗冻保护剂能尽量避免产生冰晶，增强精子的抗冻能力。但GLY、DMSO、DMF 等抗冻保护剂浓度过高同样会对精子产生毒害作用，包括引起精子顶体、颈部及尾部的损伤及破坏某些酶类等[31]。Pinho 等[32]研究发现，将GLY 与DMF 和二甲基乙酰胺（DMA）的组合作为抗冻保护剂冷冻猪精液后精子质量要明显好于单独使用GLY 组。因此，选择合适的抗冻保护剂组合以及浓度对精子冷冻效率至关重要。

2.3 氧化性损伤 氧化性损伤是指发生的氧化反应对精子的结构和活性造成的损伤。在正常状态下，活性氧（ROS）的生成和消除是动态平衡的，并且适量ROS 对机体的生理活动也是必须的。但在精液冷冻过程中，由于低温对精子的影响，精子细胞内产生大量ROS，而细胞内用于消除ROS 的抗氧化酶活性大大降低，造成ROS 在细胞内过量堆积，对精子造成不可逆的损伤[33-36]。研究表明，ROS 通过引发精子膜上的多聚不饱和脂肪酸发生过氧化反应，产生大量脂类过氧化物，从而使精子膜出现不可逆性破坏并消失，抑制精子的运动功能[35]。由于猪精子膜上的不饱和脂类含量较其他物种高，更容易发生氧化反应，导致精子冷冻质量低下，因此在猪精液冷冻过程中，更应注意氧化性损伤对精子质量的影响。

3 猪精液冷冻保存的影响因素

3.1 精液稀释液 猪精液稀释液是精子冷冻保存过程中的保护剂，对精液的冷冻效果起决定性作用。由于冷冻方法和冷冻剂型的不同，其冷冻稀释液的组成成分也不尽相同，因此目前冷冻稀释液的种类繁多。猪精液稀释液主要分为含缓冲盐和不含缓冲盐的的冷冻稀释液，含缓冲盐的冷冻稀释液主要包括甘氨酸-磷酸和葡萄糖-磷酸[37]、卵黄-葡萄糖-柠檬酸[38]、Beltsville F3（BF3）[39]、Tes-三羟甲基氨基甲烷（tris）-果糖-柠檬酸-卵黄（TEST）[40]、Beltsvle F5（BF5）[3]、Tris-葡萄糖-乙二胺四乙酸-卵黄[41]等；不含缓冲盐的冷冻稀释液主要包括卵黄-葡萄糖[2]、卵黄-蔗糖[42]及卵黄-乳糖[4]等。研究表明，精子在代谢过程中产生的一些物质会使稀释液的pH 发生变化，对精子产生不利影响，而含缓冲盐的冷冻稀释液中的柠檬酸、Tris 等缓冲物质可调节精液适宜的pH为7.0～7.5，对精液有一定的保护作用[43]。

猪精液稀释液的另一重要组成成分是冷冻保护剂，按其特性分为渗透性和非渗透性冷冻保护剂。渗透性冷冻保护剂因其相对分子质量较小，容易透过细胞膜到达细胞内部，也被称为细胞内液冷冻保护剂，其亲水性强、易与水分子结合，能在水结晶过程中限制和干扰水分子晶格的排列，抑制水分子形成冰晶。渗透性冷冻保护剂主要包括GLY、DMSO、乙二醇（EG）、丙二醇（PROH）、甲醇（MeOH）、DMF、DMA 等。GLY 是目前应用最广泛的冷冻保护添加剂之一，它能在精液冷冻降温时增加精子细胞内部的渗透压，减少精子由于失水过多而产生细胞皱缩、细胞膜结构的不可逆性破坏，从而减缓细胞膜通透性的改变，减少精子死亡。同时，GLY 含有3 个羟基，能够和细胞内的水分结合，使精子在降温过程中减少细胞内部冰晶的形成，减轻精子细胞受到的物理性损伤[31]。Zeng 等[44]研究结果显示，2%和3%的GLY 具有最佳的抗细胞凋亡作用，且B 细胞淋巴瘤/白血病-2 及其同源蛋白（Bcl-2/Bax）、肿瘤坏死因子、神经生长因子受体跨膜蛋白及其配体（Fas/FasL）的表达与精子凋亡有很强的相关性。李大吉[45]研究表明，GLY 浓度在2%～4%时冻融猪精液的精子活率和顶体完整性明显优于高浓度组。非渗透性冷冻保护剂不能自由通过细胞膜，因此又叫细胞外液冷冻保护剂，其主要特性是溶于水，但不能进入细胞，能诱导胞外冰晶网格及水分子笼型结构的形成，减轻细胞物理性损伤。非渗透性冷冻保护剂分为低分子质量和高分子质量2 种，低分子质量非渗透性冷冻保护剂主要通过改变细胞外液渗透压，促使细胞在冷冻时脱水，而在解冻时防止水分快速进入细胞，降低对细胞的损伤，其主要包括葡萄糖、果糖、蔗糖、海藻糖、乳糖等，不同浓度的几种糖类混合使用对精液保护效果更好。潘红梅等[46]将3 种双糖（乳糖、蔗糖和海藻糖）以不同比例组合添加于猪精液冷冻保护液后，发现以33.3%的乳糖和66.7%的蔗糖的组合对猪精液冷冻保护的效果最好。Gómez 等[47]研究了3 种单糖和5 种双糖对精液冷冻效果的影响，结果显示，单糖组中葡萄糖的效果最好，双糖组中海藻糖效果最好，但海藻糖效果还是明显优于葡萄糖。高分子质量非渗透性冷冻保护剂主要通过促进细胞玻璃化形成，减少冷冻和解冻过程致死性冰晶的生成，稳定细胞膜，同时部分替代渗透性冷冻保护剂以减轻冷冻液的毒性，其主要包括葡聚糖、聚蔗糖、聚乙烯乙二醇和聚乙烯比咯烷酮（PVP）等。聚蔗糖在人胚胎和牛胚胎保存上已经取得了成功，并广泛应用于多种哺乳动物卵母细胞的玻璃化冷冻保存[48]。Checura 等[49]研究在稀释液中加入不同浓度的PVP 对冻后牛胚胎发育的影响，结果显示添加6%和20%的PVP 取得了较高的囊胚率。目前高分子质量非渗透性冷冻保护剂主要用于卵母细胞及胚胎的玻璃化冷冻保存，在猪精液中的应用还比较少见。

3.2 冷冻剂型 在猪精液冷冻剂型方面，最初采用玻璃瓶、玻璃试管加入稀释液进行冷冻保存。目前，在猪精液冷冻保存研究中，分别采用颗粒、5 mL 大型细管、5 mL 不同类型塑料袋、4～5 mL 铝箔袋、1.7～2.0 mL 扁平细管、0.5 mL 中型细管和0.25 mL 微型细管等方法进行保存，这些保存方式有着各自的优缺点。Clarke 等[50]证实，颗粒法冷冻精液在冷冻和解冻时容易交叉污染，冷冻颗粒的剂量不准确，在使用便利性上存在缺陷，且解冻后精子受精率较差，因此这一包装类型在生产实践中应用较少。李林林[51]采用0.25 mL 微型细管、5 mL 大型细管冷冻猪精液，发现两者在冻后精子活力和活率的差异不显著，可在生产实践中推广使用。Eriksson 等[52]用5 mL 塑料袋冷冻猪精液，冻后精子的质膜完整率平均为60%，精子活率为50%左右，产仔率达73%，平均窝产仔数达10.7 头。Waide[53]研究结果显示，使用5 mL 铝箔袋冷冻猪精液，采用快速冷冻法的精子活率明显高于慢速冷冻法，且平均产仔率为72.9%，平均窝产仔数为8 头。Barbas 等[54]研究结果显示，扁平细管或5 mL 塑料袋在受精能力、输卵管富余精子方面比大型细管有明显优势。殷方芝[55]研究发现，5 mL 大型细管解冻后的精子活力、活率、质膜完整性都低于0.25 mL 微型细管，但差异不显著。Bwanga 等[56]利用程序化冷冻仪进行冷冻保存，解冻后0.25 mL 微型细管的精子活率明显高于5 mL 大型细管，但两者的顶体完整性差异不明显。刘德玉等[57]采用3 种细管类型（0.25、0.5、5 mL）研究了对不同公猪精液冷冻效果的影响，结果显示，相同剂型下，除0.25 mL 微型细管存在品种效应外，其余2 种剂型在解冻后精子顶体完整率无显著差异，0.5 mL 中型细管的精子活力最好，5 mL 大型细管的精子畸形率及顶体完整性最好。薛琦[58]研究表明，0.5 mL 中型细管解冻后精子活率显著高于0.25 mL 微型细管。从生产实际来说，采用大剂量包装类型可以减少精液分装及解冻的时间，提高AI 效率，但由于大剂量包装在冷冻过程中冷冻速率不一致，精子受冷不均匀，导致解冻后精子质量下降。从低温生物学技术来说，小剂量包装类型有较大的表面积/容积比，可以达到较好的冷冻和解冻速率，且适合超低温冷冻保存的形状可以提高精液冷冻质量，但由于单根冷冻保存剂量小，猪AI 一次需要的精液数量非常大，因此不利于生产实践的推广应用。目前就国内外应用来看，为了保证冷冻精子的质量，猪精液冷冻大多还是以0.25 mL 微型细管、0.5 mL 中型细管和5 mL 大型细管为主。

3.3 冷冻方法 在猪商业化精液冷冻生产中，主要采用的方法有Beltsville 冷冻法和改良Westendorf 冷冻法。Beltsville冷冻法是将采集后的精液经过两步法进行稀释，稀释后的精液采用颗粒法进行冷冻，制成0.15～0.2 mL 颗粒冻精，最后投入液氮（-196℃）贮存。解冻时，从液氮中取出冷冻精液，置于室温3 min，然后迅速投入装有BTS 解冻液的烧杯中（50℃，20 s）进行解冻。Westendorf 冷冻法是将采集后的精液经过三步法进行稀释，稀释后的精液分装在0.5 mL 中型细管、5 mL 大型细管等不同剂型里，利用程序化冷冻仪，按照初始温度为5℃，以3℃/min从5℃降至-5℃，在-5℃条件下保持1 min 结晶，然后以50℃/min 从-5℃降至-140℃，最后投入液氮（-196℃）贮存。解冻时，从液氮中取出冷冻精液，迅速在恒温水浴锅中解冻，不同剂型解冻条件有所差异：0.25 mL微型细管（37℃，30 s）0.5 mL 中型细管（50℃，12 s 或37℃，20 s），5 mL 大型细管（50℃，40 s），5 mL 扁平袋（50℃，13 s），然后在室温下用预热的BTS 解冻液进行相应浓度稀释。其中，Beltsville 冷冻法适用于猪颗粒冻精生产，Westendorf 冷冻法更适用于猪细管冻精的生产。虽然2 种猪精液冷冻法在生产实践中已被认作是标准方法，但在冷冻-解冻方法及解冻液等方面仍有改进空间。周鑫等[59]采用不同冷冻方法和解冻液优化了猪精液冷冻保存的方法，结果显示，与液氮颗粒和液氮细管法相比，采用颗粒法冷冻结合葡萄糖-乙二胺四乙酸解冻液解冻是最优的冷冻方法，使用该方法冷冻、解冻的猪精液进行体外受精后的胚胎发育率与鲜精没有显著差异，同时体外受精后囊胚率与新鲜精液无显著差异。梁鸿斌等[60]在冷冻速率和解冻温度两方面优化了猪精液冷冻的方法，结果表明，采用-120℃平衡10 min冷冻，37℃，30 s 水浴解冻方法更为适合0.25 mL 微型细管猪冷冻精液解冻。查星琴等[61]研究不同解冻液配方和解冻方法对版纳微型猪近交系（BMI）猪精液冷冻的影响，对比解冻后的精子活力、质膜完整率和顶体完整率显示，2%或3%的GLY 作为抗冻保护剂时，Ⅰ号解冻液解冻40℃、6 s 或50℃、6 s 水浴解冻效果最好。随着冷冻方法各个环节的不断优化，细管冻精解冻后精子活率已与颗粒冻精相当，加之采用细管冻精操作方便且不易交叉污染，因此，改良Westendorf 冷冻法已逐渐代替颗粒冻精并广泛应用于生产实践中。

4 展 望

尽管近年来猪精液超低温冷冻保存技术的研究取得了一定成绩，但与牛、马等家畜相比仍有很大差距，其主要原因在于：猪一次射精量大，约200～300 mL，精液对外界温度非常敏感，极其不耐冻；其次，猪是多胎动物，需要多达20 亿～50 亿枚冻精才能满足1 次配种，这给大剂量猪精液冷冻保存带来了极大困难；再者，一头种公猪的经济价值远没有种公牛高，且使用鲜精的繁殖效果比冻精更好。

根据最新报道显示，河北省廊坊市研发的猪冷冻精液技术在全国率先实现了冷冻精液配种与鲜精配种同等效果的繁育水平，冻精解冻后精子活力为74%～87%，平均受胎率在90%以上，产仔数已接近常温精液水平。尽管如此，由于猪冷冻精液所需仪器设备昂贵及操作程序复杂、对操作者技术和熟练程度有较高的要求、液氮保存和运输困难等各方面原因，猪精液超低温冷冻保存技术仍然未建立一套完整、科学的冷冻程序和保存体系，无法在生产中广泛应用。因此，针对猪精液冷冻保存技术目前存在的问题，还需从以下几个方面继续努力：第一，建立一套完整的猪精液冷冻保存技术体系，并配套快速、简便、准确的精子质量评估方法；第二，研发高通量大体积、自动化的猪精液冻存设备，制定标准化操作规程；第三，建立猪精液种子保存平台，为我国实验用猪、地方猪遗传基因保存提供支撑。