动物诺如病毒的研究进展

(河南省农业科学院畜牧兽医研究所,河南郑州 450002)

诺如病毒(Norovirus,NoV),为诺瓦克样病毒属,与札幌病毒属、兔病毒属、水疱疹病毒属和纽布病毒属同属杯状病毒科,是引起人及牛、猪、犬、猫、鼠、猴子等多种易感动物罹患急性胃肠炎的重要非细菌性病原之一。该病毒原型株于1972 年由美国学者Kapikian 用免疫电镜技术从1968 年暴发的胃肠炎患者样本中被发现,主要经粪—口途径传播,对人类和动物健康构成一定的威胁。NoV 在遗传性和抗原性方面都具有高度的变异性,不同基因型之间的基因重组频繁发生,这对病毒的生存是十分有利的。NoV 的跨种间感染与传播的潜在可能性及其相关公共卫生学问题已引起国内外学者的广泛关注。

1 病原学

诺如病毒是一种单股正链RNA 病毒,无囊膜,直径约为27～32 nm。外壳是由180 个同一种外壳蛋白组成的90 个二聚体构成。负染色电镜照片显示,NoV 具有典型的羽状外缘,表面呈凹痕的小圆状结构病毒。

诺如病毒基因组全长约7.5 kb,编码3 个开放阅读框(Open reading frame,ORF),从5′端到3′端依次为ORF1、ORF2 和ORF3。其中,ORF1 主要编码非结构蛋白,翻译加工后的6 个蛋白分子(p48、NTP、p22、VPg、Pro、Pol),在病毒基因组复制和转录过程中发挥作用。ORF2 编码主要结构衣壳蛋白VP1,VP1 是组成病毒颗粒的主要蛋白分子,有14 nt与ORF1 重叠;VP1 在功能上可分为外壳(S)区域和突起(P)区域,P 区域可与碳水化合物结合受体相互作用[1-2]。ORF3 编码1 个小的病毒颗粒相关蛋白VP2,有1nt 与ORF2 重叠。

NoV 的基因和抗原性呈高度多样性,根据病毒RNA 聚合酶和衣壳蛋白的核苷酸序列,将其分为GI、GII、GIII、GIV、GV、GVI 和GVII 7 个基因群,进一步还可分为30 多个不同的基因型[3]及不同的变异株。其中,GI 群由8 个基因型组成,GII 群包含19个基因型,GIII 群和GIV 群各包含2 个基因型,GV群只包含1 个基因型。在相同基因型和不同的基因群之间病毒均可出现重组。不同种属病毒之间的基因重组使病毒分型更加复杂,并可能促进重组病毒的跨种间传播,其中包括从动物传播到人。

NoV 是引起人类和多种动物腹泻的重要病原之一,但由于目前尚无有效的预防和治疗措施,每年都会造成巨大的直接和间接的经济和社会损失[4]。然而,随着近年来NoV 体外细胞培养系统[5]、小鼠感染模型[6]的成功构建以及鼠类NoV 功能受体[7]的发现,将会在NoV 的组织嗜性和与共生菌相互作用等方面有较为深入的研究。NoV 可在多种动物的腹泻粪便样本中被检测到,单独或伴发多种其他常见的肠道病原[8]。

2 流行病学

NoV 迄今已在欧洲、美洲、亚洲和非洲的多个国家和地区流行和暴发,成为全球重要的公共卫生问题之一。在美国约有85%以上的急性非细菌性胃肠炎的暴发与NoV 有关。NoV 是全球引起急性病毒性胃肠炎暴发流行的主要病原体之一。NoV急性胃肠炎的高发季节为秋冬季,可累及任何年龄阶段。患病动物、隐性感染动物及健康带毒动物均可为传染源。粪—口为主要传播途径,也可通过呕吐物的气溶胶传播。人为感染NoV 后,仅引起小肠绒毛轻度萎缩和黏膜上皮细胞的破坏,未见明显的肠道损伤,但可导致长期腹泻及排毒[9]。近年来,在我国多个省市流行[10-11],出现暴发流行的报道。

自20 世纪80 年代,在犊牛和猪的粪便样本发现NoV 后,陆续在鼠、羊、犬、猫科动物、野生动物等动物中也检测到了NoV。人的NoV 属于GI、GII 和GIV,猪的NoV 为GII,反刍动物(牛和绵羊等)的NoV 为GIII,狮子和犬的NoV 为GIV,鼠的NoV 目前形成GV。但血清学证据显示,也存在NoV GV 群感染其他动物的情况。因此,GV 可能在起源上不只属于鼠源性。牛和猪NoV 可使血清反应阴性的幼小动物产生腹泻和厌食。最近在羊和犬中也发现了NoV,尽管这些病毒可能已在全球传播,但它们作为病原体及其引起的疾病的重要性尚未得到重视。野生动物感染杯状病毒案例已出现,如1 头4岁的幼狮被NoV 感染后死于严重的出血性胃肠炎。在矮小黑猩猩感染的口腔中分离到杯状病毒,6 个月后又从该动物的喉拭子中再次分离到同样的病毒,表明该病毒同猫杯状病毒一样可以持续存在。在其他物种中,推测是由杯状病毒引发的感染也有报道,但在某些案例中尚不能肯定是有杯状病毒导致发病的。随着对更多物种尤其是野生动物研究的增加,会有更多的病毒归类为杯状病毒。

在众多的基因型别中,GII4 是迄今为止报道的在世界范围内流行最为广泛的基因型。利用人的NoV GII4 感染SPF 猪和牛,以小鼠感染鼠NoV 作为对照,发现人GII4 可感染SPF 猪和牛,可检测到病毒的复制和阳性血清。Caddy S L 等[12]报道从宠物犬的样本中分离到人NoV,Di Martino 等[13]在犬NoV 的血清学流行病学调查中发现NoV 可能在人类和犬中传播。这些都说明NoV 存在从动物与人之间传播的可能性,NoV 的预防和控制必须要考虑这点。在小狗和幼狮中发现的GIV 型NoV,及在狗中发现的GVI 型NoV 的报道均揭示在遗传上相关的病毒可能会在更多的其他物种中发现[14]。人们已经开始认识到犬、猫作为病毒、细菌和寄生虫的载体在人兽共患病传播中的作用,但作为肠道病毒的传播媒介则往往被忽略。

由于NoV 的快速演化和病毒株系间的重组,新的病毒株系不断演化产生[15],几乎每隔1 -3 年就会出现新的变种并在世界范围内流行,因此提出“胃肠性流感”的概念:NoV 和流感病毒在进化和宿主免疫方面非常相似,流行优势株可进化获得抗原空间并保持感染性而存活,具有导致大流行的潜能从而引起严重的社会公共卫生问题。

3 诊断

NoV 感染的确诊主要依靠实验室检测,其中最主要是通过病毒颗粒检测、病毒核酸检测、病毒蛋白质检测3 种方法来进行。

3.1 病毒颗粒检测 针对病毒颗粒常规的检测方法是电镜检测,分为直接电镜检测法和免疫电镜法。直接电镜法可以检测到直径30 nm 左右的病毒颗粒,但要求病毒载量大。免疫电镜法利用标记的抗体通过表面抗原捕获病毒颗粒,然后进行电子显微镜观察,其检出率远远高于直接电镜法。电镜检测法是早期唯一的检测NoV 的方法,可以直观地观察到病毒颗粒,但其在电镜下形态学特征并不明显,因此检测结果并不准确可靠,使得感染病例无法确诊,且操作繁杂,灵敏度较低,不适合临床检测应用。

3.2 病毒核酸检测 核酸检测方法成为NoV 检测中的常用方法,主要包括多聚酶链式反应(Polymerase chain reaction,PCR)技术和核酸探针杂交技术。PCR 技术如实时荧光定量PCR[16-17]、多重PCR,已广泛应用于NoV 的检测,并成为NoV 诊断的金标准,敏感性和特异性均较好。优点在于可进一步对病毒进行基因型的研究,不会受到获得分型单克隆抗体的限制,对流行病学研究具有重要意义。不足在于时间相对较长、价格较贵,尚有待于进一步研究更加快速、准确的检测方法。

NoV 基因型复杂,不同型间的序列变化大,大多数检查方法仅能针对一种或几种型进行检测,这在实践应用中受到了限制。随着检测技术的发展,尤其是PCR 技术的应用,对NoV 的传播特点(特别是跨物种传播)、分布规律与遗传演化规律的研究具有重要意义。同时,PCR 技术还促进了NoV 序列的积累,这不仅有助于了解病毒基因组特征,而且还加深了对其遗传演化机制的认识。

3.3 病毒蛋白质检测 病毒蛋白检测方法主要是利用抗原抗体反应来实现对病原体的检测。该方法的灵敏度和特异性与抗原和抗体的亲和力有很大关系。目前较常用的NoV 免疫学检测方法包括:酶联免疫吸附试验,放射免疫法、生物素-亲和素免疫法等。使用单克隆抗体捕获样品中的病毒抗原来进行检测的方法(夹心ELISA)由于交叉反应性小,特异性强且敏感度较高,成为研制NoV 检测采用的主要方法。放射免疫法灵敏度比免疫电镜法可提高10～100 倍,可检出抗体消长水平;不足是耗时长,且需要放射性同位素标记。生物素-亲和素免疫法的灵敏度与放射免疫法相当。

4 预防

NoV 具有基因组内及基因型间高度变异的特性,使得疫苗无法有效交叉保护。病毒样颗粒(Virus-like particle,VLP)可作为非复制型颗粒黏膜免疫的良好模型,利用基因充足来嵌合表达不同毒株的抗原决定簇,从而制备嵌合VLP 疫苗以期能在疾病暴发时表现强大的力量[18]。

研究VLP 的表面结构和受体结合域,有助于鉴定外源蛋白潜在的插入位点,将有助于提高VLP 组装和结合受体的有效性。基于人和鼠NoV 的细胞培养研究,希望在不久的将来能有商品化的疫苗可以投入使用。但是,NoV 的快速演化为流行病学的研究和疫苗的研制提出了挑战,未来对NoV 疫苗的研究还需不断努力。

在有效的疫苗使用之前,NoV 的预防措施应遵循以切断传播途径为主的原则,注意饲养卫生、环境清洁、避免料源水源污染等,防止疾病的传播和流行。

5 展望

目前,对NoV 的基因组、蛋白结构及免疫机制方面有了相对较全面的认识。由于NoV 进化迅速,不能有效地培养及缺少恰当的动物模型等种种原因,限制了人们对NoV 的深入研究。特别是在NoV的感染、致病机理、组织嗜性、病毒与宿主相互作用,靶细胞受体,在细胞内的复制过程等基础研究相对较少,这严重限制了人们对NoV 的认识。然而,随着分子生物学技术的发展及对NoV 分子生物学认识的不断深入,以及NoV 体外培养和动物感染模型的逐步完善,相信未来的研究定能在致病机理方面有较大的突破,并探索出有效的预防和控制策略。然而,对我国NoV 的分子生物学特征,如病毒的全基因结构、致病机理、病毒重组和进化等方面的了解并不多,故在这些方面很有必要进行更加深入地研究[19]。

NoV 引起的病毒性胃肠炎是全球性公共卫生问题,其在世界范围内持续存在,与其不断地变异和进化有着密切的关联。根据NoV 具有变异较快这一特点,建立广泛的监测网络对流行的NoV 分子分型进行监测,对于疫苗研究、预防控制大规模暴发流行等具有十分重要的意义。此外,重组DNA 技术的出现及其在生物技术产业中的应用为动物传染病的诊断提供了新的方法,因为重组的抗原缺乏宿主的胞内蛋白,从而能够大大降低假阳性反应的发生率,提高了快速性、特异性和各种诊断检测的灵敏度。作为一种新的诊断方法,渴望能够用于NoV 的检测。