CREBRF基因及其功能研究进展

张艳敏，刘 颖，李文通，杨亚岚，葛长利，陈其美，周 荣，李 奎

（1.山东蓝思种业有限公司，山东日照 276800；2.中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，北京 100193；3. 佛山科技学院生命科学与工程学院，广东佛山 528231）

2008年圭尔夫大学的研究者利用酵母双杂交技术在人脑cDNA文库中发现Luman/CREB3募集因子（Luman/CREB3 Recruiting Factor，CREBRF）[1]。研究发现，CREBRF基因在小鼠的不同组织、发情周期的不同阶段以及卵巢颗粒细胞中呈现时空特性表达[2-3]，且在凋亡颗粒细胞中CREBRF蛋白与促凋亡蛋白CHOP、Caspase-12共表达，暗示CREBRF基因可能在卵泡选择中发挥重要作用[3]。在敲除实验中，CREBRF基因敲除雌鼠的体内激素分泌发生了显著变化，生产后的母鼠表现出乳腺发育缺陷、母性行为缺失、无关行为活跃等现象[4]。最新研究也表明，CREBRF基因作为山羊子宫内膜上皮细胞中自噬的潜在激活剂，雌二醇和孕酮能够通过mTOR途径增加CREBRF蛋白的表达，从而在前列腺素分泌和细胞附着中起着核心作用[5]。分析CREBRF基因缺陷型细胞显示，裂解感染期间细胞内的HSV-1基因表达和病毒产量显著增加，说明CREBRF蛋白可能通过隔离重要的辅助因子或感染所需的必需效应因子对细胞起保护作用[6]。CREBRF基因还被证明是一种有效的胶质瘤抑制剂，能够阻断CREB3/ATG5通路中缺氧诱导的自噬[7]。在萨摩亚人群中进行的全基因组关联分析发现，CREBRF的一个突变体rs373863828与肥胖增加有关[8]，同时也能显著降低Ⅱ型糖尿病的患病风险[9]。近十年的研究表明，CREBRF基因在机体代谢、疾病治疗，尤其在哺乳动物繁殖过程中扮演着重要角色。而目前关于CREBRF基因对哺乳动物繁殖过程的调控研究主要集中在小鼠上，且其中明确的生物学功能和分子机制报道还相对较少。因此，本文主要概述CREBRF基因及其对哺乳动物繁殖调控的研究，有助于探索CREBRF基因的生物学功能。

1 CREBRF基因

1.1CREBRF发现及结构特征 Luman募集因子因能够与Luman蛋白的亮氨酸拉链样区域结合而被命名，由加拿大圭尔夫大学研究人员利用酵母双杂交技术在人脑的cDNA文库中发现。Luman是CREB家族的一个成员，又称为CREB3，因此Luman募集因子（Luman/CREB3 Recruiting Factor，LRF）又可以缩写为CREBRF。CREBRF蛋白是一种未折叠蛋白应答响应亮氨酸拉链转录因子，该基因编码639个氨基酸，组成分子量为71.981 ku的蛋白分子，蛋白结构包含1个高度酸性的区域，1个典型的bZIP区域和1个亮氨酸拉链样的结构域[1]。在人类和已研究的动物中，CREBRF蛋白结构极其保守，对人、小鼠、大鼠的CREBRF蛋白进行序列比对，发现小鼠和大鼠的氨基酸序列的同源性超过95%[1]。

1.2CREBRF在不同组织中的表达规律 目前对CREBRF基因的表达研究主要集中在小鼠上。研究表明，CREBRF基因在小鼠的脂肪、脑、肠、心脏、肾脏、肝脏、肺脏、骨骼肌和睾丸中都有表达，其中在心脏和肾脏中的表达水平较高[1]。杨延周[3]对CREBRF基因的长期研究发现，CREBRF在卵巢的各级卵泡、凋亡的颗粒细胞中有不同程度表达。在小鼠发情周期的不同阶段也呈现时空特异性表达模式，CREBRF基因在小鼠发情期间期的子宫和输卵管以及发情后期的卵巢中表达水平较高[2,10]。此外，CREBRF在卵母细胞和早期胚胎中也有表达，CREBRF在4细胞期的胚胎与囊胚中的表达水平高于卵母细胞和其他发育阶段的胚胎[2,10]。在小鼠胚胎植入初期的子宫腔上皮细胞、腺上皮细胞以及围绕着胚胎的基质细胞、子宫内的初蜕膜区和次蜕膜区的着床部位，CREBRF都有较高水平的表达[11]。上述研究证明，CREBRF基因在小鼠生殖系统以及繁殖过程中呈现出不同的时空表达模式，表明其在发情周期、胚胎植入和子宫内膜基质细胞蜕膜中可能具有至关重要的生物学功能。但目前对CREBRF基因功能的报道甚少。

2 CREBRF蛋白的生物学功能及研究现状

2.1 CREBRF与Luman CREBRF蛋白是一种重要的内质网应激相关的亮氨酸拉链转录因子，通过抑制Luman蛋白的转录激活而对内质网应激反应有负反馈调节作用。Luman/CREB3是CREB家族的主要成员，CREB家族具有非常保守的bZIP区域及特异的疏水性内质网跨膜区域的结构基序。Luman是内质网相关的重要跨膜蛋白，发生内质网应激反应时，Luman蛋白被类似调节ATF6的膜内水解机制分裂，通过蛋白质水解切割被释放[12]，然后Luman N端蛋白进入细胞核内，从而导致下游应激反应相关的基因活化[13-14]。Luman作为一种多功能蛋白，最初被鉴定为与单纯疱疹病毒（Herpes Simplex Virus，HSV）相关的宿主细胞因子1（Host Cell Factor，HCF1）的相互作用蛋白[12]。除了参与HSV的潜伏和再激活，Luman还参与人类免疫缺陷基因调控[15]、白细胞迁移和功能发挥[16-17]、树突状细胞的成熟[18]、糖皮质激素受体信号的传导[19]等。CREBRF是Luman在哺乳动物内质网应激（Endoplasmic Reticulum Stress，ERS）和未折叠蛋白反应（Unfolded Protein Reaction，UPR）中的负反馈调节因子，其提供亮氨酸序列的C端区域在与Luman亮氨酸拉链区域相结合后，促进其降解，从而调节Luman表达，负反馈参与ERS[1]。CREBRF通过2个途径来发挥加速抑制Luman蛋白的作用，一方面是隔离Luman到核小体，阻止其与HCF-1等反式激活必需的辅因子相结合；另一方面，CREBRF蛋白的半衰期只有 20 min，在细胞内CREBRF蛋白的稳定性受蛋白酶体的调节，其在蛋白酶体的作用下易于降解，因此Luman蛋白会随着CREBRF蛋白的降解而降解，这也是继 Luman 蛋白水解和入核活动后CREBRF蛋白对Luman蛋白的另一种水平的调节[1]。可以看出，CREBRF和HCF-1 都是在核内与Luman相互作用的蛋白，但HCF-1是普遍的细胞周期调节因子，是Luman转录激活必须的辅助因子，而CREBRF则是起到抑制Luman蛋白反式激活的作用[20-21]，两者可能对Luman蛋白起到相反的调节作用。

2.2 CREBRF在糖皮质激素受体信号传导中的作用CREBRF基因敲除雌性小鼠在哺乳期存在严重的母性行为缺失、乳腺发育缺陷以及糖皮质激素受体（Glucocorticoid Receptors，GR）信号显著增强等现象[4]。第1次分娩的CREBRF基因敲除母鼠除了挖掘和筑巢行为增强，照顾幼鼠相关的活动明显减少，由于母鼠母性缺失和疏于喂养导致80%的幼崽在出生后24 h内相继死亡，而如果刚出生的幼仔交由野生型哺乳期母鼠哺乳和照顾，幼鼠就会存活[4]。对幼鼠的看护和哺乳可以刺激乳汁分泌和母性行为，催乳素（Prolactin，PRL）是快速诱导母性行为发生的重要激素。野生型小鼠的血清中PRL在妊娠晚期显著升高，产后第12天下降到产前的正常水平，而在CREBRF基因敲除母鼠产前和产后的血清中PRL明显降低。进一步分析发现，在初产泌乳期，CREBRF基因敲除雌鼠的乳腺导管末端分枝明显少于野生型泌乳期小鼠，表明CREBRF可能是通过调节丘脑下部-垂体-性腺轴对内分泌激素（如PRL等）的分泌起调控作用[4]。GR通过与PRL的启动子区结合对PRL的合成与分泌进行下调，而CREBRF蛋白能够抑制GR的转录活性并促进其蛋白降解，在CREBRF基因敲除的哺乳期母鼠体内，GR的分泌由于CREBRF蛋白的缺失而明显升高，进而抑制了PRL的合成和分泌，使得母鼠的母性行为减弱[4]。还有研究表明，在小鼠妊娠过程中，CREBRF蛋白的表达还会受到雌激素和孕酮的调控[22]，进一步调节丘脑下部-垂体-性腺轴的作用，影响初产雌鼠对幼鼠的哺乳和照顾等母性行为，但是具体的生理调节机制还需进一步探索。

2.3 CREBRF在子宫蜕膜化中的作用 子宫蜕膜化即子宫内膜基质细胞的增殖、分化与多核化而形成一种特殊组织的过程，对胚胎的着床、妊娠的建立与维持以及分娩的发动都有着极为重要的作用。研究发现，在小鼠子宫中，CREBRF蛋白在基质细胞发生蜕膜化时显著上调[11]，在基质细胞体外诱导蜕膜化实验中，进一步证明CREBRF基因被干扰后会导致子宫基质细胞增殖受限，细胞周期相关蛋白的表达也发生异常[23]，暗示CREBRF可能在基质细胞蜕膜化过程中发挥一定作用。在子宫蜕膜过程中，基质细胞的一系列变化被不同的细胞周期因子所调控[24]。CREBRF基因被干扰后，细胞周期调节因子cyclin A与cyclin B1的表达下降，引起细胞周期的S期阻滞，而细胞周期调节因子cyclin E与cyclin D3的mRNA表达并没有明显变化[25]。这可能是由于cyclin D3与cyclin E主要在细胞周期的G1期发挥作用，并不参与S期与G2/M期的细胞周期调控[26]。cyclin A和cyclin B作为周期蛋白依赖性激酶1（Cyclin-Dependent Kinase 1，Cdk1）的活化因子，两者均在细胞周期G2/M期的有丝分裂过程中发挥重要作用，而且cyclin B1敲除能使胚胎致死[27]。但CREBRF影响细胞周期素cyclin A和cyclin B具体的分子调节通路仍需要进一步探究。

2.4 CREBRF介导的内质网应激途径在卵巢颗粒细胞凋亡过程中的作用 内质网是机体合成蛋白的重要细胞器，真核细胞中的蛋白质需要在内质网腔内进行正确地折叠以及成熟，然后根据功能不同将蛋白质转移到细胞膜上发挥功能或释放到细胞外发挥调控作用。内质网中蛋白质折叠和成熟的效率是对细胞内环境与外界刺激的积极响应，尤其是在分泌细胞与恶性肿瘤细胞中[28]，高质量的蛋白折叠对细胞的功能、存活和正常的生理功能维持至关重要。内质网通过检测蛋白质的合成、折叠、装配、运输和降解来维持细胞内稳态，当错误折叠或未折叠的蛋白在内质网中积聚，而内质网又无法快速、正确地处理时（ERS），细胞内某些相关的信号通路就会被激活，调节细胞产生一系列的反应（UPR），以加快内质网中蛋白的正确折叠，维持内稳态，或使细胞发生自噬，诱导细胞凋亡，UPR是内质网处理蛋白折叠或降解的一种质控机制，是内质网发生应激后引起的后续反应[29-30]。UPR的生理学功能是维持精确的内质网功能，并对细胞内的蛋白量进行控制[31]。UPR活化可以促进细胞存活，但在机体环境异常情况下，ERS和UPR均无法处理这些未折叠或错误折叠的蛋白时，机体就会启动凋亡程序[32]，进而导致多种疾病的发生和发展[33-36]。在卵泡发育过程中，颗粒细胞和卵母细胞的生长发育是相互协调和相互依赖的过程，颗粒细胞具有芳香化酶活性[37]，通过产生雌激素对卵泡生长和排卵起着重要的作用[38]，其功能障碍可能导致不育[39-40]。近年来的研究表明，ERS可能诱导颗粒细胞的凋亡[41-42]，进而引起卵泡闭锁[43]。在缺氧、代谢异常、营养不足或过剩等异常情况下，机体内质网发生应激反应[44]，然后通过ERS和UPR途径引起颗粒细胞凋亡，卵泡随之发生闭锁，异常高的闭锁会导致慢性不孕和/或过早终止生育[45]。Luman是内质网膜上的转录因子，对内质网起着重要的调节作用，而CREBRF蛋白能够抑制Luman的活性，负反馈调节ERS和UPR[1,46]。目前研究发现，在卵母细胞及原始卵泡、初级卵泡、次级卵泡和成熟卵泡中均检测到CREBRFmRNA和CREBRF蛋白，提示CREBRF可能通过内质网应激途径调控颗粒细胞的增殖和分化，乃至凋亡，进而参与卵泡的生长、发育、成熟及排卵等过程。

3 总结及展望

CREBRF基因在机体代谢、疾病治疗，尤其在哺乳动物繁殖调控过程中的生物学功能已有初步报道。家畜的繁殖性能在很大程度上影响着现代规模化农业生产的经济效益，因此探究哺乳动物繁殖过程中精确的分子机制是研究者和生产者一直致力于解决的问题。已有研究表明，机体在某些异常情况下的ERS和UPR会诱导卵巢颗粒细胞的异常凋亡，而在原始卵泡发育到成熟卵泡的过程中，在颗粒细胞中检测到CREBRF基因和蛋白表达，暗示CREBRF可能通过ERS途径对颗粒细胞凋亡有抑制作用。总之，在卵泡选择、子宫蜕膜化或植入等方面，CREBRF基因都有着潜在的重要功能，明确其在动物繁殖过程中的具体生物学功能和调控机制，可为高繁殖力家畜的选育工作确定新的辅助靶标，提高现代畜牧生产的经济效益。