呼吸道感染牛分枝杆菌对肝脏和肠道影响的病理组织学观察

王振玲,李淼煊,孙 欣,程广宇,刘春法,岳瑞超,王 杰,廖 轶,周向梅

(1.北京农业职业学院,北京 房山 102445;2.中国农业大学动物医学院,北京 海淀 100193)

结核病(TB)是一种起源很早的可共同感染人与动物的慢性传染性疾病。在19世纪终期才被Robert Koch证实为细菌性疾病,至此人们才开始进一步研究和了解该病,其多为结核分枝杆菌复合群(Mycobacterium tuberculosis complex,MTBC)引起。据世界卫生组织(WHO)提供的信息,仅在2016年就有170万人死于结核病(四分之一感染有艾滋病病毒),其中只有近5%死亡发生在高等收入国家。我国结核病新发病例数位于印度和印度尼西亚之后,是危害我国公共健康的重大传染病之一。

结核分枝杆菌复合群根据基因组多样性和宿主倾向性,分为结核分支杆菌(M.tuberculosis)、牛分枝杆菌(M.bovis)、非洲分支杆菌(M.africanum)、Caprae分支杆菌(M.caprae)等。前两种分支杆菌是对全球影响最大的病原体,宿主范围极广,可在人、宠物、家畜以及野生动物之间相互传播。2012年Kira E.F.Ramdas[1]等人发现猫的肺中出现结核病变,而其主人患有结核病。该病的传播途径多种多样,可通过分泌的乳汁、排出的尿液、粪便、脓液和痰、以及呼出的气体,污染食物、垫料等经呼吸道、消化道进入机体,即直接接触传播或者接触患病动物的呼气和排泄物传播[2]。

近10年由于我国牛奶和牛肉市场需求增大,奶牛养殖行业飞速发展呈规模化、集约化,牛结核病发病率出现逐步攀升的势头,阳性率甚至高达9%[3]。据估计,上个世纪前叶,牛结核病造成的家畜损失高于其他传染病的总和,对于整个养殖行业的经济有着严重的影响。同时,人们可以通过饮用未杀菌的牛奶或未加工的生牛肉感染结核病[3],其威胁着我国十几亿人口的健康,因此,研究和防治牛结核病迫在眉睫。

1 材料与方法

1.1 试验菌株 本试验所用牛分枝杆菌致弱株由中国农业大学国家动物海绵状脑病实验室保存。

1.2 实验动物 于某牛场购买3～6月龄的犊牛,用PPD和IFN-γ释放试验检测为结核病双阴性,隔离饲养于圈舍。

1.3 试验方法

1.3.1 细菌悬液的制备 在7H9液体培养基中接种细菌,培养于恒温37℃的摇床中。培养6～8周后,倍比稀释菌液并接种于7H10固体培养基中,然后开始菌落形成单位(CFU)计数,将细菌数量为1×103CFU的菌液置于-80℃冰箱中保存待用。

1.3.2 动物的分组及接种方法 将6头犊牛分为对照组和试验组,每组各3头,做标记。选用滴鼻吸入接种的方法,用5 mL注射器吸取菌液2 mL,试验组犊牛每头每侧鼻孔注入1 mL,感染剂量为2×103CFU。

1.3.3 病理组织学观察 将两组犊牛有病变或疑似有病变的部位(心、肝、脾、肺、肾、淋巴结、胃、肠等器官)切取下来,固定于10%福尔马林。样本固定后经常规组织处理,石蜡包埋,2～4 μm切片,采用H.E.染色,放于光学显微镜下观察,采集图像并记录观察结果。

2 试验结果与分析

2.1 病理组织学观察

2.1.1 肝脏 低倍镜可见肝小叶中肝细胞索排列紊乱,肝细胞肿胀,中央区域肝窦消失(见中插彩版图1A)。可见肉芽肿形成初期,大量炎性细胞浸润,有的聚集形成嗜碱性深染的炎性灶(见中插彩版图1B)。还见到粉色均质物质中心为部分蓝染钙化的干酪样坏死,外周有炎性细胞浸润,其中含有马蹄形或圆形多核巨细胞(见中插彩版图1C)。

高倍镜可见肝细胞肿胀呈多角形,胞核偏向一侧,细胞质减少呈弱嗜酸性,胞间界限不明显。肝血窦中充满红细胞,部分可见狄氏隙(见中插彩版图2A)。浸润的炎性细胞有的胞核圆且嗜碱性深染,胞质极少为淋巴样细胞,有的细胞核呈分叶或杆状,胞质嗜酸性染色,为嗜中性粒细胞。肉芽肿早期的炎性灶区域的细胞呈两端尖中间圆的梭型,胞质减少呈浅粉色,胞核大而空亮,出现上皮样细胞增生和纤维化(见中插彩版图2B)。钙化中心周围肝细胞坏死形成一片均质红染无结构的团块样物质,偶见嗜碱性深染的崩解的细胞核碎片,外缘有数个细胞核排列在细胞周边围成马蹄或圆形的多核巨细胞,胞浆丰富呈浅粉色(见中插彩版图2C)。

2.1.2 肠道 低倍镜可见十二指肠部分黏膜层上皮脱落,中央乳糜管周围有炎性细胞聚集浸润,局部有出血现象,十二指肠腺腺管偶见扩张含有均质粉染的分泌物,腺上皮细胞呈扁平状(见中插彩版图3A)。空肠固有层增厚,出现轻度增生,黏膜下层的结缔组织疏松水肿(见中插彩版图3B)。盲肠有轻度充血,固有层与肠绒毛脱离,结缔组织疏松水肿并伴有炎性细胞聚集形成炎性灶(见中插彩版图3C)。

高倍镜可观察到十二指肠炎性细胞主要是淋巴样细胞,细胞核呈圆形、蓝染,胞浆较少,其次是嗜中性粒细胞,胞浆饱满嗜酸性染色,含有分叶状细胞核。固有层中含有黄褐色的含铁血黄素,有出血(见中插彩版图4A)。空肠李氏隐窝间的结缔组织疏松、水肿(见中插彩版图4B)。

十二指肠偶见炎性细胞聚集,主要是淋巴细胞和嗜中性粒细胞,毛细血管充血。盲肠肠腺的潘氏细胞数量增多,可观察到圆而深染嗜碱性且几乎无细胞质的淋巴样细胞和细胞核为分叶状的嗜中性粒细胞(见中插彩版图4C)。

3 讨论

本试验采用滴鼻吸入的方式,采集消化系统中肝脏和肠道,观察牛分支杆菌对肝和肠道的影响。病理组织学观察中发现肝脏出现典型肉芽肿结节,中心为钙化中心,包裹于坏死组织中,外周炎性细胞浸润并含有多核巨噬细胞,还发现小叶间的结缔组织疏松水肿并增生,小叶尤其是中央静脉周围出现淋巴样细胞炎性灶,这与程广宇[4]、壬大孝[5]等人的文献一致。在之前的文献报道中,鲜有报道牛分枝杆菌对于肠道的影响,本文的结果发现,其对消化道的损伤没有形成明显的肉芽肿,仅有多个聚集的炎性灶,结缔组织的增生等。Domingo M.[6]等人的研究显示,脏器出现可观察到的或典型结核病变通常与病畜的感染途径有关,如果通过饮食,经消化道感染,则可能在感染动物的肠系膜淋巴结中造成损伤,但很少或几乎不会在肠壁上看到损伤。肠道的结核主要见于人结核分支杆菌对于人回盲部的影响,分为溃疡型、增生型和混合型。本研究使用牛分枝杆菌通过鼻腔吸入的方式观察肝脏和肠道的损伤,因未进行牛分枝杆菌的分离培养或者标志性检测确诊,这种肉芽肿是否是结核特异型还是普通的炎症反应还需要进一步证实。

经牛分枝杆菌感染部位,引发细胞和体液免疫,聚集大量的免疫细胞包括巨噬细胞、T细胞、树突状细胞。曾经人们一度以为肉芽肿可以抑制结核菌的生长增殖,然而随着研究深入,大家的看法有些改变。牛分支杆菌的免疫反应缺陷和躲避免疫的毒性机制可使其被巨噬细胞吞噬,存活于其中并繁殖,形成潜伏性感染[7]。当自身抵抗力变弱时,分支杆菌会再次增殖。巨噬细胞在肉芽肿形成的早期,主要为M1型极化,促进肉芽肿的形成并保护宿主,然而在以后的过程中逐步向M2型极化转变,结核肉芽肿所在微环境炎症状态也有微妙变化,使得肉芽肿保护宿主的作用减小。这种极化的改变对于结核分支杆菌的潜伏感染起到正向作用,提高宿主的敏感性和发病率[8]。总之,宿主感染牛结核分支杆菌后自身的免疫反应呈双面性,一方面保护宿主形成肉芽肿,限制病原体扩散,另一方面该菌通过自身躲避机制,利用宿主的免疫细胞进行生长增殖。