简述荧光蛋白

王裕鹏

(海南省洋浦经济开发区洋浦中学 洋浦 578000)

染色和标记是细胞生物学研究常用方法。早在荧光蛋白发现之前，免疫偶联荧光标记、化学荧光染料直接标记等技术已广泛应用于生物分子的研究中。而荧光蛋白的发现及后续改造，为生命科学基础研究提供了更为完善和系统的标记工具，为探索活细胞中微观生命的活动规律创造了机会，推动了人们对生命进一步的认识。

1 荧光蛋白的发现及分类

1.1 绿色荧光蛋白 1962年，下村修从维多利亚多管水母中分离到一种蛋白，在紫外线激发下它可以发出绿色荧光，即绿色荧光蛋白(GFP)[1]。他还采用生物化学方法初步推测了GFP的发光位点和发光基团[2]。普拉舍于1985至1992年间完成了GFP基因和蛋白质序列的测定，并确定了发光位点[3]。随后科学家解析了GFP的晶体结构[4]。首次将GFP应用于生物学研究的是马丁·查尔菲，他通过分子生物学技术将GFP的cDNA在线虫等模式生物中表达[5]，使人们意识到GFP作为报告基因的巨大潜力。钱永健团队解析了GFP的发光机制[6]，并通过突变对GFP改造，得到了一些荧光亮度更高、吸收峰单一、构象折叠效率高的突变体，如GFP-S65T[7]。为了表彰他们在绿色荧光蛋白研究中做出的巨大贡献，2008年诺贝尔化学奖授予了下村修、马丁·查尔菲和钱永健三位科学家。

1.2 红色荧光蛋白 1999年，Matz等从珊瑚虫中分离出了能在紫外照射下发出红色荧光的蛋白质——红色荧光蛋白(RFP)[8]。其中，DsRed是最早用于研究的红色荧光蛋白，2001年Yarbrough等人解析了它的晶体结构[9]。相比于GFP，它有更高的荧光强度，成像背景低，并能激发和发射更长的波长。很多时候，研究者可同时使用GFP和DsRed对不同蛋白质进行双标记可完成GFP无法独自解决的问题。但DsRed在应用中也因成环氧化过程缓慢、易寡聚化等缺陷，限制了其在一些研究中的应用。随后科研人员对其进行一系列的遗传改造，使其成为真正意义上的RFP。

1.3 其他类型的荧光蛋白 为了扩大荧光蛋白的用途，科研人员基于光谱特性作了进一步的改造，得到了不同颜色的突变体。例如，突变GFP获得了蓝色(BFP)、青色(CFP)、绿色(GFP)和黄绿色(YFP)四组不同颜色的荧光蛋白，其光谱范围覆盖蓝色至黄色[10]。RFP突变衍生出了橙色、红色和近红外光谱的荧光蛋白。以上变种的光谱几乎覆盖了可见光范围，极大地提高了荧光蛋白标记选择的灵活性。此外，随着人们对荧光蛋白的不断研究，科研人员又从其他物种分离了各种荧光蛋白，发现它们会因物种的不同在结构、性质和发光机制上也有所差异。

2 荧光蛋白的理化性质

GFP是由238个氨基酸组成的分子量约为27 kD的单体蛋白。其二级结构是11条β折叠链组成的圆柱体状，还有一条α螺旋链沿圆柱体中轴分布，我们称之为β罐[4]。GFP能产生荧光是因为内部的丝氨酸-酪氨酸-甘氨酸(第65～67位氨基酸残基)形成了生色团，该生色团位于圆柱体中心的α螺旋上，为自己创造了一个稳定的环境。生色团内的分子可环化形成对羟基亚苄基-咪唑啉酮，这种化学键能被激发发光[3]。该过程是自动催化完成的，不需要底物和其他蛋白质的修饰，唯一需要氧气作为辅助因子参与化学键形成时的脱氢反应[4，6]。

DsRed是由225个氨基酸组成，分子量约为26 kD的蛋白质。与GFP相比，两者在一级结构上同源性很低，但二级结构的相似度很高，也能形成β罐[9]。其生色团是由谷氨酰胺—酪氨酸—甘氨酸(第66～68位氨基酸残基)组成。生色团的形成两者也有差异，DsRed会先形成类似于GFP的生色团中间体，再经氧化反应，才转为红色荧光生色团[11]。总的来看，DsRed的生色团是GFP生色团的延伸。

3 荧光蛋白的应用

由于荧光蛋白的众多优点，使其广泛应用于生物学的多个领域。

3.1 蛋白质定位和功能研究中的应用 荧光标记和示踪是荧光蛋白最基本的功能，也是目前细胞生物学研究的重要手段。例如，研究一种蛋白质在细胞中的分布时，可将目的蛋白基因和荧光蛋白基因融合到同一质粒中，构建融合基因表达载体，并转染至细胞内，表达的融合蛋白能行使目的蛋白的生物学功能，又有荧光蛋白的发光特点。随后借助激光共聚焦显微镜分析目的蛋白的亚细胞定位。此外，上述融合表达载体还可用于启动子分析、基因表达调控等的研究。

3.2 蛋白质互作研究中的应用 蛋白质互作是生命现象发生的基础，研究其互作可以阐明生物反应的机理，揭示生命现象的本质。目前，基于荧光蛋白的荧光共振能量转移(FRET)技术和荧光互补(FC)技术已成为研究蛋白互作的有效手段。以FRET技术为例，FRET现象涉及两种荧光蛋白，分别作供体和受体，要求供体的发射谱与受体的吸收谱重叠，当两者距离很近时(1～10 nm)，光子能量将从供体转移至受体，使受体发出荧光。目前，最常用的一对供受体是基于GFP突变的青色荧光蛋白(CFP)和黄色荧光蛋白(YFP)。例如，研究a、b两种蛋白质间是否互作，就可以将CFP基因和YFP基因分别与编码a、b蛋白的基因融合到同一质粒，并在同一细胞中表达。如果a、 b蛋白发生互作，CFP和YFP也会因a、b蛋白构象的改变而靠得很近，从而发生FRET现象。此时就能检测到YFP发射的荧光，而CFP发射的荧光会大大减弱甚至消失。