癌症免疫疗法研究概述——2018年度诺贝尔生理或医学奖解读

李艺柔 吴 思 赵 静

(河北师范大学生命科学学院 石家庄 050024)

2018年诺贝尔生理或医学奖颁发给了美国免疫学家James P. Allison和日本生物学家本庶佑(Tasuku Honjo)，以表彰两位科学家在癌症治疗的免疫负调控领域所做出的卓越贡献。与传统的肿瘤疗法不同，免疫治疗基于新的变革性的理念： 激活或改造人体免疫系统抵抗肿瘤的固有功能，并使其成为攻击癌细胞的有力武器。

20世纪90年代，James P. Allison发现细胞毒T淋巴细胞相关抗原4(cytotoxic T lymphocyte-associated antigen-4， CTLA-4)可以对免疫系统起到“刹车”作用，他意识到如果能够解除免疫系统的“刹车”机制，就可以提高免疫系统对肿瘤细胞的攻击能力，为癌症治疗开创了全新的免疫疗法思路[1]，James P. Allison也因此荣获2015年拉斯克奖。在Allison发现CTLA-4可以起到免疫系统抑制剂作用之前，Tasuku Honjo团队于1992年首次鉴定并克隆了程序性细胞死亡蛋白-1(programmed death-1， PD-1)，并最终确认PD-1起着免疫系统“制动器”作用[2]。2014年，PD-1阻断药物纳武单抗OPDIVO(Nivolumab)在日本获批临床应用。除此之外，还有数位科学家(如华人学者、耶鲁大学教授陈列平以及丹纳·法伯癌症研究院的Gordon Freeman等)也在这一领域做出了关键性的突破。具有卓越临床疗效的癌症的免疫疗法的创立为人类治愈癌症带来了希望。

1 癌症免疫疗法的早期研究

1813年，法国医生Arsène-Hippolyte Vautier注意到感染了气性坏疽的癌症患者出现肿瘤自行消退的现象,这一发现引起了人们对使用细菌治疗肿瘤的关注；1868年，德国医生W.Busch利用丹毒感染癌症患者，显示了一定的肿瘤治疗效果，而该项研究结果在1882年又被德国内科医生Friedrich Fehleisen所证实；19世纪90年代，被誉为“免疫疗法之父”的美国医生William B. Coley通过为一个肉瘤患者注射丹毒而消除了其身上致命的肉瘤，并在此基础上创立了“Coley毒素”疗法。

20世纪早期，德国科学家Paul Ehrlich因发现补体的效应功能并提出抗体侧链形成理论，与俄国科学家Ilya Ilyich Mechnikov共同分享了1908年的诺贝尔生理或医学奖；1909年，Paul Ehrlich进一步讨论了自然免疫和获得性免疫在对抗癌症过程中的不同效应。1915年，美国医生Leo Loeb发现免疫系统在影响实验移植肿瘤的生长过程中扮演了重要角色，并首次提出了激素和肿瘤的发生有关。

20世纪50年代，美国科学家Richmond T. Prehn等采用近交系小鼠实验模型，发现肿瘤细胞表面存在特异性移植抗原；20世纪70年代，澳大利亚免疫学家Frank Macfarlin Burnet提出“免疫监视”理论，即机体的免疫系统能够通过细胞免疫机制识别并清除癌变的异常细胞。

1977年美国科学家Eva Klein等人提出肿瘤浸润淋巴细胞的免疫疗法概念；1986年，美国科学家Steven A Rosenberg首先提出了肿瘤细胞免疫疗法的基本原理，并进行了临床试验： 将在体外获得淋巴因子激活的杀伤细胞(LAK)回输给患者，用于肿瘤的治疗[3]，这就是第一代肿瘤细胞的免疫治疗——LAK细胞疗法。

2 CTLA-4的发现及免疫检查点抑制剂概念的提出

1980年，美国科学家John A. Hansen利用单克隆抗体技术首次发现T细胞表面分子CD28；1986年，美国科学家Paul J. Martin发现CD28可以发挥共刺激作用介导T细胞激活；四年以后，CD28的天然配基B7被鉴定。无独有偶，1987年，在CTLA-4 被Brunet研究团队鉴定的同一年，其cDNA随后便被法国科学家Pierre Goldstein实验室团队克隆[4]。研究人员证实CTLA-4与CD28都是免疫球蛋白(Ig)超家族成员，有单个胞外Ig结构域，但其功能仍然未知。1991年，美国科学家Peter Linsley等人采用基因重组方法构建了一种可溶性嵌合蛋白——CTLA-4-Ig，并且证明了相较于CD28， CTLA-4具有与B7更强的结合能力。在之后的几年中，学术界普遍认为CTLA-4与T细胞共刺激分子CD28一样能激活T细胞活化。1994年，Walunas等人通过阻断性抗体研究，发现CTLA-4其实是T细胞活化的负向调控因子[5]。在Walunas等人的研究成果发表后不久，James Allison团队于1995年也得到了同样的结论。

随着CTLA-4功能的揭示，一些研究人员开始尝试将CTLA-4对淋巴细胞的负调控作用作为治疗自身免疫疾病的新手段。然而，Allison却开辟了一条新的思路，他对CTLA-4进行了深入的研究并发现，阻断CTLA-4诱导的免疫负调控作用，免疫系统的束缚就会被解除。1994年，Allison研究团队将CTLA-4的抗体注射入患有肿瘤的小鼠体内，通过激活小鼠体内的抗肿瘤T细胞成功治愈了患癌小鼠，并在同年的圣诞节期间对该实验结果进行了重复验证[6]。之后又有其他研究人员证明，阻断CTLA-4可在体外和体内增强T细胞应答，并发挥抗肿瘤作用。这些实验结果证实了Allison先前提出的通过阻断CTLA-4可增强T细胞抗肿瘤反应的假设。Allison等人还发现，免疫系统具有“免疫记忆”功能，注射CTLA-4抗体后的小鼠拥有对肿瘤的记忆，免疫系统会对二次接种的肿瘤细胞再次发动攻击。

这项工作标志着一种新的肿瘤免疫疗法的诞生——即利用单克隆抗体解除免疫抑制作用来对肿瘤进行治疗，免疫检查点抑制剂(immune checkpoint inhibitors， ICI)的概念也随之被提出。Allison实验室还进行了许多不同类型肿瘤模型的动物实验，研究范围包括前列腺癌、乳腺癌以及黑色素瘤，并针对性地采取了不同组合的免疫联合疗法。短时间内，Allison团队证明了免疫检查点疗法对不同类型的癌症动物模型均有疗效。

1999年，抗CTLA-4单克隆抗体MDX-010(后改名为伊匹单抗，ipilimumab)被Medarex生物技术公司成功开发。之后美国的施贵宝公司收购了Medarex生物技术公司并继续开发应用于临床的伊匹单抗。丹纳·法伯癌症研究院医生Stephen Hodi和Stephen Hodi与施宝贵公司的科学家通过研究新的免疫检查点疗法促进了肿瘤临床治疗的新发展。

3 PD-1/PD-L1通路的作用机制及其在免疫响应中的作用

1992年，Tasuku Honjo团队在日本京都大学的实验室首次鉴定并克隆了PD-1，Honjo等人起初并没有想到PD-1抑制剂会成为治疗肿瘤的药物。一次偶然的机会，他们通过消减杂交技术，发现了PD-1的mRNA在小鼠濒临死亡细胞中的超表达现象，并因此认为该基因可能参与调控细胞凋亡，并将“程序性细胞凋亡”(programmed cell death)的英文首字母作为其基因命名——“PD”。Honjo团队通过对PD基因开放阅读框的基因序列的分析，推测其可能是Ig超家族中的新基因，预测编码一段跨膜蛋白；1994年，Honjo实验室的Takashi Shinohara等人报道了PD-1基因的染色体定位[7]；之后，他们又在1996年利用PD-1单克隆抗体技术证明了PD-1在活化的T细胞、B细胞以及未成熟淋巴细胞表面均有表达。

1996年，Honjo团队用一只具有C57Bl遗传背景的敲除PD-1基因小鼠进行了首次功能验证实验，发现敲除PD-1的小鼠起初具有轻微的脾肿大和B细胞浸润表型，而在晚年实验小鼠出现了系统性红斑狼疮病症。在此之后，研究人员用各种遗传背景的小鼠进行了PD-1敲除实验，发现与CTLA-4基因敲除的小鼠类似，在实验小鼠体内不同类型的T细胞驱动了自身免疫疾病。因此，Honjo得出结论： PD-1具有与CTLA-4类似的免疫抑制功能。研究人员通过分析其氨基酸序列，发现PD-1具有一段基于免疫受体酪氨酸的转换基序(ITSM)，并且认为PD-1与CD28/CTLA-4为同一类蛋白受体家族成员[8]。

1999年，华人学者、耶鲁大学教授陈列平团队首次鉴定了B7-H1分子，但是当时并未证明它会与PD-1发生结合[9]。2000年，Gordon Freeman在陈列平教授发现B7-H1之后，证明了B7-H1/PD-1的相互作用，并将这一分子改名为PD-1的第一个配基(PD-L1)。在此之后，PD-1的第二个配基(PD-L2)CD273也很快被Gordon Freeman、 Tasuku Honjo和Arlene Sharpe的合作团队发现；2002年，陈列平教授和Honjo等人发现B7-H1充当了肿瘤细胞的“盾牌”，使后者免遭T细胞的攻击，并首次将B7-H1应用于肿瘤免疫方向。

2004年，陈列平团队发现B7-H1(PD-L1)敲除小鼠并没有明显的自身免疫表型，只是在肝脏部位有一定的免疫活化，这一工作进一步验证了B7-H1的免疫负调控作用，并且检验了这一途径作为药物靶点的安全性[10]；2005年，陈列平团队发现，相比于正常细胞，肿瘤细胞表面会更高水平地表达PD-1的配基蛋白；同年，研究人员首次报道了将PD-1受体的抗体应用于小鼠肿瘤模型临床治疗。Honjo等人的伟大发现为我们今天将PD-1/PD-L1信号通路应用于临床治疗提供了大量的理论依据： 首先Honjo等人发现抗PD-1疗法可以诱导抗肿瘤免疫反应，并且这种反应不依赖于肿瘤细胞表面PD-L1/PD-L2的表达；其次，抗PD-1疗法可以发挥与抗CTLA-4疗法相同甚至更好的疗效，但PD-1免疫疗法的副作用比CTLA-4免疫疗法更小。大多数肿瘤细胞而非正常细胞可以高表达PD-L1实现免疫逃逸，而通过抗体在体外或体内阻断该途径均可以恢复T细胞特异性攻击肿瘤细胞的免疫功能，PD-1/PD-L1整个通路机理的逐渐清晰，为肿瘤免疫治疗带来了新的机遇。

4 免疫检查点抑制剂疗法的现在与未来

2014年，威尔·康奈尔医学院的Alexandra Snyder等人利用大规模并行测序，确定了在黑色素瘤患者中可从CTLA-4阻断治疗中获益的遗传基础；2015年，纪念斯隆凯特琳癌症中心的Timothy A. Chan等人又在非小细胞肺癌中发现肿瘤内的新抗原会影响肿瘤对PD-1抗体治疗的响应情况;同年，美国丹纳·法伯癌症研究院等处的研究人员发现一些能通过新型癌症免疫疗法得到治疗的转移性黑色素瘤患者所产生的肿瘤抗原并不相同，这说明免疫疗法靶向的分子靶标可能因人而异。

2017年，FDA批准了两种嵌合抗原受体T细胞免疫治疗(CAR-T)，每个人个性化的免疫细胞被重新设计来攻击癌症。2018年的研究结果表明，肿瘤环境中转化生长因子-β(TGF-β)的表达可以使癌细胞躲避免疫系统的识别，这项发现为患有不同癌种的转移性癌症患者，以及具有较差预后但尚未发生肿瘤转移的患者开发首个免疫治疗药物开辟了新的道路。

综上所述，利用抗体药物发挥免疫负调控作用的机制是十分复杂的，CTLA-4和PD-1/PD-L1分子通路由于具有不同的受体动力学表达模式，使它们在免疫反应中发挥着互补作用；新的临床研究结果也表明，靶向作用CTLA-4和PD-1的联合疗法对黑色素瘤病人会有更加显著的疗效。目前，针对多种不同类型癌症的免疫检查点疗法应运而生，一些新的检查点蛋白也被尝试用于癌症的靶向治疗。相信在不久的将来，该疗法将从各个水平得到优化，从而发挥更好的疗效。这也再一次说明了James Allison和Tasuku Honjo工作的开创性贡献，他们的发现为肿瘤疗法提供了新的思路和手段，是人类抗击癌症的里程碑式的标志。