基因编辑技术在作物育种上的应用研究进展

肖义军 黄艳萍 (福建师范大学生命科学学院 福州 350108)

品种培育在农业生产中的地位十分重要，人类自从种植作物以来，就在不断地选育具有经济价值的作物性状，这实际上是在利用作物的自然基因突变。随着改造自然能力的提高，人类又开始利用辐射和化学诱变等手段人为加快突变频率，以便更快更好地获得作物新品种。但无论是天然突变还是诱发突变，突变的产生都是随机的，需要经过艰苦漫长的选育过程才能得到稳定的新品种，一个新品种的育成往往需要十几甚至几十年的不懈努力。分子生物学的发展使得人们可以采用基因工程手段加快作物育种，转基因技术在作物育种中取得了极大成功。然而由于生命活动的复杂性，目前对其中的规律并不完全清楚，所以公众对外源基因的导入是否会引起作物自身产生一些无法预料的变化，从而影响转基因作物的安全性，存在广泛的质疑。由于特异性核酸酶的发现，目前出现的新一代基因工程技术——基因编辑技术可通过对作物自身基因进行精确改变，而不需要外源基因的导入就能培育新品种，因而受到了作物育种家的极大关注，将对农业生产产生巨大的影响。本文介绍基因编辑技术在作物育种上的应用前景及目前面临的挑战。

1 基因编辑技术

基因编辑技术是指对基因组中的某些DNA序列进行定点改造的遗传操作技术，其基本原理是通过人工构建能特异性切割DNA序列的核酸酶，对目的基因片段进行精准的靶向剪切，使DNA双链断裂，随后激发细胞内的DNA修复机制，产生基因修改。常用的核酸酶主要有锌指核酸内切酶(zincfinger nucleases， ZFNs)、类转录激活因子效应物核酸酶(transcription activator like effector nucleases， TALENs)以及成簇规律的间隔短回文重复相关蛋白9核酸酶(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated protein 9 nuclease， CRISPR/Cas9)，其中CRISPR/Cas9技术系统以其简单、精确、高效和低成本而得到广泛应用。

1.1 CRISPR/Cas9系统的作用机制 CRISPR/Cas系统最初发现于细菌及古细菌中。作为细菌的免疫防御系统，通过靶向结合降解外源DNA，能对外来病毒和噬菌体的侵染产生抵制作用。这些存在于微生物基因组且包含间隔重复序列的位点被命名为成簇规律的间隔短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats， CRISPR)。CRISPR/Cas系统通常分为两大类： 第Ⅰ类是有多个Cas蛋白组成的复合体来行使核酸酶功能，第Ⅱ类是由单个Cas蛋白(如Cas9等)行使核酸酶功能。CRISPR/Cas9属于第Ⅱ类，只需要成熟的cr RNA(CRISPR-derived RNA)、tracr RNA(trans-activating chimeric RNA，反式激活嵌合RNA)和单个Cas9蛋白(核酸酶)就能实现对外源DNA的切割[1]。人工改造的CRISPR/Cas9系统主要由引导RNA(single guide RNA， sgRNA)和Cas9蛋白结构域组成。其中，sgRNA起精确定位作用，其5′端前20个核苷酸序列决定Cas9蛋白特异性切割基因组DNA的部位；工作时，CRISPR/Cas9系统的sgRNA和Cas9形成嵌合蛋白，切割与sgRNA 5′端前20个核苷酸序列互补的DNA双链，产生DNA双链断裂，然后通过同源重组或非同源末端连接修复途径产生基因突变。

1.2 DNA断裂修复机制 基因编辑有两个关键点： 一个是对基因的精确剪切，另一个是细胞DNA的自身修复。正常情况下细胞中一旦出现DNA双链断裂，细胞就会启动DNA自我修复途径，同源重组与非同源末端连接是细胞修复DNA双链断裂的两种常见方式。

非同源末端连接是断裂处两端的DNA在一些修复元件的参与下直接修复的通路，是主要的修复机制，通常引起部分碱基的丢失，少数情况下也会有碱基插入，导致的结果是基因敲除。非同源末端连接技术相对简单，没有外来DNA的插入，造成的基因功能丢失类似于天然突变的结果，但它远比天然突变的效率高，也远比化学物理诱变精确，是目前基因编辑技术在农作物育种中的主要作用方式。

同源重组是以损伤区域DNA的同源序列作为模板进行的精确修复，可保证基因组的准确性。同源重组可以实现精确的基因替代，其意义远比非同源末端连接重大。但由于其是通过基因替代的方式来实现精确的基因编辑，通常需要引入与断裂处原序列相同的DNA修复模板，使之以同源重组的方式原位插入到染色体中，这就涉及到了外源DNA转入的问题。但与传统转基因不同的是： 首先，这个基因是该作物的可杂交品种中已经存在的同源基因，这样的作物品种采用传统杂交技术也能做到，只是后者更费时费力而已；其次，在传统的转基因过程中，外源基因是随机整合到基因组中，而同源重组则是精确地将基因插入到基因组中的预定位置。如果人们能接受杂交育种的话，则没有理由不接受这样的作物，因为传统杂交实际存在将目的性状基因附近的DNA片段带入的可能性，结果更不可控。

2 基因编辑技术在作物育种中的应用

由于目前公众对转基因食品的诸多质疑和法律对转基因食品的严格约束，作物育种家越来越多地将注意力转移到了基因编辑技术，因为该技术具有以下优越性： ①可研究、鉴定和筛选与重要性状相关的基因；②能更准确快速地设计、改造作物品种；③可有针对性地聚合多个优良性状，以提高植物的抗性、产量或改良品质。目前基因编辑技术已应用于水稻、小麦、西红柿、马铃薯和烟草等多种作物的育种中。

2.1 作物抗性性状的改良 通过基因编辑技术定点敲除抗性负调控因子基因或增强正调控因子的基因表达，以及通过编码区定点替换改变相关基因功能，都能在不同程度上提高作物对环境的抗性，是作物抗性育种的重要途径。

白粉病是由麦类白粉菌引起的病害，主要危害大麦、小麦等禾本科植物，降低其产量。大麦的白粉病病原菌感病基因(MLO)功能的丧失可获得对白粉病的广谱抗性。非洲野生大麦中存在自然突变的抗性品种，通过与欧洲原有种植大麦杂交，培育出了具有持久抗性的大麦品种。但在自然界中无法找到天然突变的小麦抗白粉病抗性植株，因为小麦是六倍体，自然情况下6个MLO等位基因基本不可能同时发生突变，而二倍体大麦与六倍体小麦存在生殖隔离，大麦突变品种不能与小麦进行杂交。研究人员运用TALENs技术定点突变小麦的6个等位基因，创制出一种对白粉病有持久广谱抗性的新型小麦品种。

稻瘟病是水稻的重要病害，常造成水稻产量的大面积减产，目前主要的防治手段是施用农药与培育抗病品种。但过量使用农药易造成环境污染、产生耐药性等问题。Wang等[2]利用CRISPR/Cas9系统对水稻中负责调控稻瘟病菌的抗性基因(OsERF922)进行精准敲除后，培育出抗稻瘟病的纯合突变株系。

柑橘溃疡病是柑橘生产上最严重的病害之一，而导致溃疡病的则是柑橘的关键感病基因(CsLOB1)。研究人员利用CRISPR/Cas9技术对CsLOB1的编码区进行定点编辑，获得的突变体植株对溃疡病的抗性显著增强。

随着除草剂在作物生产上的广泛应用，培育抗除草剂的作物新品种是作物育种的一个重要目标。高彩霞团队采用优化的CRISPR/Cas9系统获得了对草甘膦具有抗性的水稻品种。乙酰乳酸合酶(acetolactate synthase， ALS)是支链蛋白质合成通路中的第一个重要酶，ALS中特定氨基酸突变可以提高植物对乙酰乳酸合酶类除草剂的抗性。已有不少研究通过基因编辑的手段对其部分碱基进行突变，获得了抗磺酰脲类除草剂的水稻突变体[3]。

2.2 作物产量的改良 在作物产量改良方面，目前在水稻上做的工作较多，主要是通过对相关产量的负调控因子基因进行定向修饰达到增产的目的。多个实验室的工作发现，采用基因编辑技术对相关基因进行定点修饰后，可获得每穗粒数增加、单粒更重、株型能直立且具有分蘖少、植株矮化等性状的突变株系[3]。

小麦粒长和粒重负调控基因(TaGASR7)和直立型密穗基因(TaDEP1)是小麦的产量相关基因，ZHANG[4]等利用瞬时表达CRISPR/Cas9系统对产量相关基因进行定点编辑后，发现获得的纯合突变株分别出现粒重显著增加、株系明显变矮的性状。

番茄的开花阻遏物基因(SP5G)负责合成抗成花素激素，若抗成花素激素含量增加，则开花时间延迟、产量降低。SOYK等[5]利用CRISPR/Cas9技术对野生番茄的SP5G基因进行定向突变后，番茄的开花和成熟时间能提前2周左右，且产量显著增加。

2.3 品种品质的改良 直链淀粉含量与水稻品质密切相关。MA等[6]利用CRISPR/Cas9技术靶向突变水稻直链淀粉合成酶基因(OsWaxy)，所获突变体的直链淀粉含量从14.6%下降至2.6%，由此获得了糯性品质。SUN等[7]利用CRISPR/Cas9技术对水稻糖苷水解酶基因(BE1)和淀粉分支酶Ⅱb基因(BEIIb)进行定点编辑，虽然BE1突变株相比野生型在粒型、总淀粉含量、直链淀粉含量等指标上未有显著差异，但BEIIb突变株相比野生型粒型显著变小、总淀粉含量和直链淀粉含量均显著增加。

在水稻的8号染色体上存在的甜菜碱醛脱氢酶基因(OsBADH2)表达时，水稻不具有香气。利用TALENs技术敲除水稻品种“日本睛”中的OsBADH2基因，使无香味的稻米产生了香味[3]。

双孢菇(Agaricusbisporus)有6个多酚氧化酶基因，非常容易褐变。利用CRISPR/Cas9技术敲除双孢菇的1个多酚氧化酶基因，获得的突变双孢菇中多酚氧化酶的活性降低了30%，具有了抗褐变能力。抗褐变蘑菇于2016年4月成为第一个豁免美国农业部监管的CRISPR编辑作物[8]。

2.4 创制水稻雄性不育系 光、温敏核雄性不育系的发现使杂交水稻由三系法走向两系法，传统方法获得一个光或温敏核雄性不育系品种通常需要十年左右时间。上海交大和华南农大利用基因编辑技术对水稻相关基因进行编辑，分别获得了光、温敏核雄性不育系，大大加快了培育进程[3]。

3 基因编辑技术在作物育种上面临的问题

3.1 技术方面的问题 目前主流的基因编辑技术是CRISPR/Cas9，但目前该技术尚存在两个重要的技术问题： ①脱靶效应(Off-target effects)，因为在基因组中存在许多相似序列的DNA片段，核酸酶在切割特定基因片段时，有可能会切割相似序列而产生错误切割，这种在特定位点之外的错误切割造成非预期基因突变的现象称为脱靶效应。②外源基因的问题，目前CRISPR/Cas9常规的方法是首先将sgRNA和Cas9蛋白基因构建到合适的载体中，再经由载体导入到细胞中来培育获得基因修饰的植株，然后通过自交或杂交的办法将外源基因剔除，尽管在最后的植株中没有外源基因，但操作过程中实际是有外源基因导入的，而且，如果采用质粒做载体，降解后的小片段质粒DNA有可能会插入宿主DNA中而无法检测出来。从目前技术发展的趋势看，这两个问题应该不难得到解决。尽管CRISPR/Cas9技术出现至今只有5年左右，但技术已进行了多次优化，如： 目前利用Cas9变体已经可以将脱靶效应降低到检测不到的水平[9]，基于CRISPR/Cas9的植物基因组单碱基编辑系统和植物基因组定点插入和替换系统，以及全程无外源DNA的DNA-free植物基因组编辑系统[3]等不断出现和改进。此外，目前基因编辑技术应用于作物育种主要是通过定点敲除靶标基因，造成基因的功能缺失来实现性状改良，因此敲除的基因必须是目标性状的负调控因子。多数情况下，作物性状改良需要获得基因功能，所以基因定点替换或插入显得更为重要。但植物细胞中同源重组效率很低，目前已报道的植物基因组片段定点替换效率在水稻、玉米和拟南芥中普遍低于1%[3]。大部分控制重要农艺性状的正调控基因目前还无法高效、精准地进行编辑，这一情况极大地限制了基因编辑技术在作物育种上的应用。

3.2 法律监管方面的问题 基因编辑技术的出现为作物分子育种提供了极好的机遇，但对于基因编辑作物是否属于转基因生物，目前国际上尚未有明确一致的定论，其监管标准存在较大争议。美国农业监管部门认为基因编辑作物(genome edited crop， GEC)是通过细胞自我修复机制产生的突变体，与作物自然突变以及物理化学方法诱导的突变极为相似，因此GEC不被定义为转基因生物(genetically modified organism， GMO)[10]。美国农业监管部门目前已认定通过ZFNs技术创制的低植酸玉米、通过TALEN技术创制的耐冷藏马铃薯品种和高油酸、低亚油酸大豆，以及通过CRISPR/Cas9技术创制的抗褐化双孢菇和抗除草剂玉米等5种基因编辑作物新品种不属于GMO范畴。欧盟认为只要有外源DNA转入，不论最终植物中是否存在外源DNA，都被定义为GMO。事实上，从科学角度来讲，基因编辑诱导的突变与自然突变以及物理和化学方法诱导的突变结果完全一样，最终产品无法区分。中国目前对于基因编辑作物的监管标准尚无明确的规定。尽管基因编辑技术出现才十多年的时间，但已显示出了对农业、医学的重大影响力，目前我国的基因编辑技术处于世界前列，合理的政策法规对正确引导我国基因编辑育种技术的发展至关重要，而基因编辑育种技术的发展应用对于我国的粮食安全性十分重要。