乙酰肝素酶靶向治疗心肌梗死的前景

曹洪帅 马俊彪 韩轩茂

(内蒙古科技大学包头医学院，内蒙 包头 014040)

乙酰肝素酶(HPSE)是一种内切性β-D-葡萄糖醛酸糖苷酶，是哺乳动物细胞中唯一可以切割细胞表面的硫酸乙酰肝素侧链的酶，参加细胞外重塑。HPSE涉及多种生理过程如胚胎植入，组织修复和炎症过程；病理致病过程主要包括肿瘤的进展和肾脏疾病。HPSE在多种恶性肿瘤病理发展过程中呈现高表达、高活性状态，有可能成为一个抗肿瘤治疗的新靶点〔1〕。本文探讨HPSE在心肌缺血再灌注(I/R)损伤发病中的作用，及可能的分子机制，为今后心肌梗死的监测、治疗及预后评估开辟新方向，具有重要的基础及临床意义。

1 HPSE的认识

硫酸乙酰肝素(HS)蛋白聚糖(HSPGs)在血管生物学中的广泛发生，1999年Vlodavsky等〔2〕通过提纯HPSE分离得到HPSE基因，该基因通过肝素结合型碱性成纤维细胞生长因子的活化，诱导血管生成。HSPGs通过联合结构、生化及其调控等不同机制发挥多重功能作用，通过与其他大分子如层黏蛋白、纤维蛋白和胶原Ⅰ、Ⅳ相互作用，有助于细胞外基质和基底膜的结构完整性、自我排列及不可溶性，可密切调控细胞-细胞外基质间的相互作用，参加细胞外重塑。HPSE mRNA编码65 kD前体酶，经翻译后切割成非共价缔合以形成活性HPSE的8 kD和50 kD亚基。HPSE结构中含有酶的活性位点和底物结合结构域，及HPSE分泌和信号传导功能至关重要的C-末端结构域。HS的生物合成在高尔基体系中进行，HS链的合成和修饰需要一系列酶的活性，但哺乳动物HS的降解主要由一种酶——HPSE进行，其将HS侧链切割成10～20糖单位的片段。随后的研究表明，HPSE参与各种病症如癌症，慢性炎症，动脉粥样硬化和肾功能障碍等的发病与进展〔3〕。这些研究最有价值的成果就是，HPSE从一种不太了解功能的模糊酶发展成为一些肿瘤疾病的药物靶点，为肿瘤疾病的治疗及预后评估开辟新方向，拓宽了HPSE抑制剂在其他领域的临床应用范围，具有重要的基础及临床意义。

2 HPSE对疾病的影响

鉴于HS的功能多样性，HPSE的降解深刻影响着重要的病理生理过程，包括肿瘤发展，新生血管形成和炎症，糖尿病及肾脏疾病的进展。肝素酶介导的降解和随后的肾小球细胞中HS的重塑是肾小球疾病发展的关键机制。血管是一种高度活跃的结构，其形态可以在系统和局部变化下做出快速调节适应并维持血管功能。在一些病灶中如再狭窄、血栓形成、动脉粥样硬化，这种正常有益的适应可能对整体功能有害。HPSE依赖对动脉结构力学和修复的酶学的独立作用密切调节血管内支架术后的动脉顺应性和新生内膜增生。此外，HPSE促进血管损伤后的血栓形成，并有助于人类颈动脉粥样硬化中的促凝血状态。重要的是，HPSE与动脉粥样硬化斑块的发展和进展密切相关，包括对不稳定斑块转变稳定。因此，急性心肌梗死患者血浆中HPSE水平明显升高，有可能作为急性心脏病诊断标记和潜在的药物治疗靶点〔4〕。HPSE诱导细胞因子产生机制尚未完全明了，但包括toll样受体(TLRs)，TLRs是I型转膜蛋白的一个家族，结合一系列细菌产物，通过核因子(NF)-κB激活促炎性介质〔5〕。HPSE诱导细胞因子似乎涉及TLR-2、TLR-4、和NF-κB。HPSE经TLR激活巨噬细胞，产生炎症因子，促进炎症反应：许多研究显示，炎症在冠状动脉疾病中起关键作用。活化的免疫细胞在斑块破裂处密集存在，产生大量的炎症分子和蛋白水解酶，促使稳定斑块向易损、不稳定转化〔6〕。HPSE，NF-κB和热休克蛋白(Hsp)70基因表达参与三硝基苯磺酸(TNBS) 诱导的炎症反应，代表肠道抗炎药物的药理学靶点〔7〕。

HPSE表达在正常上皮细胞中是罕见的，但通常在肿瘤中诱导，在各种类型的癌症(包括宫颈癌)中升高，与预后不良相关。异种移植小鼠模型用于研究体内HPSE辐射调节剂的作用，辐射后的集落形成测定以比较对照HPSE敲低和HPSE过表达HeLa细胞之间的辐射响应。检测缺氧诱导因子(HIF)1，碱性纤维母细胞生长因子(bFGF)和血管内皮生长因子(VEGF)的mRNA和蛋白水平作为HIF1通路活性的指标。研究结果表明，HPSE是体内和体外辐射反应的重要调节剂〔8〕。

在糖尿病，心脏对产生能量的脂肪酸(FA)具有单一依赖性，通过分解循环甘油三酸酯的冠状动脉脂蛋白脂肪酶(LPL)来实现。冠状动脉LPL源于心肌细胞，并转移到血管腔，该酶需要从肌细胞表面HSPGs中释放出来，这是慢性高血糖后需要持续的活性。有研究表明，在肝素酶过表达(HPA-tg)的转基因小鼠中发现HPSE可以改善葡萄糖体内平衡。除了胰岛组成和结构的变化之外，HPSE过量表达与增加的葡萄糖刺激的胰岛素分泌和高胰高血糖素血症有关。引人注目的是，与野生型相比，在给予单次高剂量链脲佐菌素(STZ)的动物使胰岛B细胞损伤，从而导致相关的高血糖严重和快速发展的模型中，HPA-tg小鼠显著降低血糖，揭示使用HPSE在糖尿病管理中的可行性机会〔9〕。

3 HPSE的调控表达

3.1调控相关的信号转导通路

3.1.1丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号转导通路 MAPK信号转导通路可以参与调控多种细胞生物学效应，尤其是在细胞增殖、分化及凋亡过程中，是多种信号转导途径的共同作用部位。MAPK被激活后转移至细胞核内，使一些转录因子发生磷酸化，改变细胞内基因表达的状态。另外，它也可以使一些其他的酶发生磷酸化，活性发生改变。在哺乳动物细胞内存在的重要MAPK亚家族主要包括细胞外调节激酶(ERK)，c-Jun N-末端激酶/应激激活的蛋白激酶(JNK/SAPK)和p38MAPK。

近年来有研究发现，HPSE可以通过影响MAPK信号转导途径，促进肿瘤细胞的恶化与侵袭过程。Nadir〔10〕发现在肿瘤细胞内存在HPSE过表达现象，由于HPSE过表达导致MAPK被激活，激活MAPK后转移至细胞核内，使发生磷酸化，改变细胞内基因表达的状态。另外，它也可以使一些其他的酶发生磷酸化、活性发生改变，促进肿瘤细胞的转移和侵袭因子的增强。说明可以通过抑制HPSE的表达从而阻断MAPK信号转导途径，为抑制肿瘤细胞的恶化与侵袭提供新的方向。

3.1.2磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)途径 PI3K不仅有抗凋亡作用而且是一种重要的信号转导分子。HPSE过表达后，PI3K通过其p85亚单位与活化的受体结合，使其p110亚单位被受体磷酸化而活化。PI3K可催化三磷酸肌醇(PIP3)的产生。PIP3产生后，通过结合蛋白激酶(PK)B的PH结构域，将其锚定于质膜而活化。PKB是原癌基因c-Akt的产物，故又称为Akt。PKB可磷酸化多种蛋白，最终结果就是组织细胞凋亡，引起血管生成，促进了肿瘤细胞的增殖。破坏HPSE C-末端结构域或抑制HPSE的表达均可以降低Akt的磷酸化水平，起到抑制肿瘤病情进展的作用。

3.2HPSE的调控 肿瘤缺氧时，可以激活HPSE，HPSE高表达过程或参与了对其活性的调控。HPSE的生理活性与环境pH密切相关，最佳表达活性pH为5.5～5.8，这时HPSE发挥其酶活性，结合HS。当pH>7.0时，HPSE的酶活性被其黏附活性所取代，无法发挥酶切作用。当pH下降，如炎症时，HPSE则可发挥其酶活性，裂解它所连接的HSPG，释放白细胞，并促发炎症反应〔11〕。

HPSE启动子区域富含GC结构，可以结合相关的调控因子调节HPSE的表达。另外HPSE还存在甲基化位点，启动子的甲基化可以抑制HPSE的表达，而DNA的去甲基化可以上调HPSE的表达水平。简言之，HPSE的表达调控在转录水平主要通过结合转录因子和甲基化来实现的。

凡可以与HPSE启动子区所含的核心基序GGGCGG结合的转录因子，都可以调控HPSE的表达，其中早期生长反应基因(EGR1)，转录因子Sp1，NF-κB，E-twenty six转录因子(ETs)家族因子 (ETs1 和 ETs2) 等对HPSE的表达起正向调节作用，此外还包括由雌二醇和葡萄糖通路所诱导的部分转录因子；而抑癌基因 p53 和 DNA 甲基化可抑制HPSE的转录，是HPSE表达的负向调控因子。

近年来在Hao等〔12〕研究中，首次报道肝细胞生长因子(HGF)调节HPSE表达以促进胃癌转移。研究发现HGF和HPSE在58例胃癌患者中显著表达。 而且HGF和HPSE的高表达与TNM期，侵袭深度和预后差呈正相关。在MKN74细胞中，外源性HGF在mRNA和蛋白质水平上显着增加HPSE表达。

MicroRNAs(miRNAs) 是一类保守的非编码单链 RNA，约8～25 个核苷酸，通过与靶基因 mRNA 互补位点的结合在转录后水平调控靶基因的表达。miRNA-558在HPSE启动子中识别出其互补位点，以降低SMAD家族成员SMAD 4在Argonaute 1-依赖性方式的结合。有实验表明〔13〕，miR-558通过减弱SMAD4介导的HPSE表达抑制来促进胃癌细胞系的体外和体内肿瘤发生和侵袭性。在临床胃癌标本中，miR-558的上调和SMAD4的下调与HPSE表达呈正相关。

4 HPSE在I/R模型中的影响

尽管HPSE聚糖在血管生物学中的广泛发生和影响，但HPSE在血管壁疾病中的意义被低估。有研究显示，血液和动脉组织HPSE过度表达，在急性冠脉综合征(ACS)发病中起双重作用，协同促进动脉粥样硬化和血管内血栓形成〔3〕。几项研究表明，HPSE的过度表达及其对HSPGs的破坏可能是许多与糖尿病相关并发症的原因，特别是导致慢性肾脏疾病，动脉粥样硬化和ACS〔14〕。

心肌I/R损伤是指缺血心肌在恢复灌注以后，病情反而加重，引起的心肌超微结构的不可逆性改变，造成心肌功能、代谢及电生理方面的进一步损伤。心肌I/R损伤常见的机制有Ca2+超载、氧化应激、凋亡与自噬等，一些微小RNA及TLRs等也参与其中，这些机制相互联系，相互作用。心肌纤维化，又称为心肌钙化，是由中、重度的冠状动脉粥样硬化性狭窄引起心肌纤维持续性和(或)反复加重的心肌缺血缺氧所产生的结果，导致逐渐发展为心力衰竭。

有资料显示〔15〕，I/R是急性肾衰竭和延迟移植功能的重要原因，可通过激活肾小管细胞的上皮至间质转化(EMT)而诱导慢性肾损伤，HPSE在其中可能具有重要的作用。在WT和HPA-tg小鼠中诱导急性缺血。将WT和HPA-tg小鼠用戊巴比妥钠(50 mg/kg，皮下注射)麻醉，并置于受控加热(温度调节)台上，保持体温在37℃。暴露右侧和左侧肾动脉并夹持30 min，在此期间肾脏保持温暖和潮湿。然后取出夹子，观察肾脏血流返回，并缝合腹壁切口。使小鼠在温暖的笼中恢复48和72 h，并在每个时间点获得血液样品以测量肌酸酐。所有小鼠通过吸入CO2然后颈脱位处死。收获肾并称重。除了肾动脉夹紧之外，进行相同操作的假手术小鼠作为对照。结果发现I/R在动物模型中引起HPSE上调，过表达HPSE的小鼠活化EMT，与野生型相比，HPA-tg动物对肾功能损伤更敏感。总的来说，研究结果表明HPSE是I/R诱导EMT的发展的关键因素，其抑制可能代表一种新的有价值的治疗方法，以最小化预防纤维化。

5 HPSE的靶向治疗进展

综上，HPSE的表达与肿瘤的恶化和转移有着密不可分的联系，理论上通过抑制HPSE的活性可以降低肿瘤细胞的转移性和侵袭力，为临床上，控制肿瘤的转移开辟新的途径。基于序列分析，二级结构预测和诱变分析，通过研究HPSE水解五糖底物磺达肝素的光谱，表明HPSE以保留配体的形式水解其底物，因此HPSE被确定为保留糖苷酶〔16〕。目前，HPSE抑制剂的研究取得了突破性进展〔17〕，主要来源于多糖化学修饰、高通量的天然产物，一方面可以降解HPSE，另一方面可以抑制HPSE的表达，尤其是HS类似物-PI88已经进入临床研究阶段，且在研究阶段志愿者身上呈现出较好的耐受性和疗效。PI88不仅是HPSE的抑制剂，也是血管生成因子VEGF的阻抗因子，达到抗血管生成的目的，最终阻滞肿瘤的发展。

Singh等〔18〕使用APC Min+/-小鼠模型提供证据表明，HPSE下调了p21 WAF1/CIP1的表达，p21表达的下调增加了HPSE新出现的促致癌性质的新特征。值得注意的是PG545是有效的HPSE抑制剂，该化合物有效降低细胞增殖，集落形成和肿瘤异种移植物生长，与p21表达明显增加相关。PG545有效诱导p21使其抗肿瘤作用表现乐观。

随着免疫学与分子生物学的快速发展，针对HPSE的免疫治疗和基因治疗研究也取得了显著成果。HPSE 仅在肿瘤组织、淋巴组织中存在表达，提示我们可以研究一种广谱的肿瘤转移相关抗体拮抗HPSE达到抑制肿瘤转移的目的。有研究表明，诱导多肽抗体生成可以有效地降低肝癌细胞的 HPSE 活性，从而降低了肝癌细胞的侵袭能力，为研究抗 HPSE 抗体和临床使用的疫苗提供了新的理论依据。在基因治疗水平方面，Parish等〔19〕发现乙酰肝素酶与活化的Jurkat T细胞中数百种基因和微RNA的启动子和转录区域相互作用，并且上调许多靶基因/微RNA。在分子水平上，通过影响去甲基化酶对转录活性基因的募集，核肝素酶似乎调节组蛋白3赖氨酸(H3K)4甲基化。总体上通过miRNA与HPSE启动因子的mRNA结合位点结合，调节信号通路，下调生长因子的表达，阻止肿瘤转移。

6 展 望

目前，多数研究集中于冠状动脉粥样硬化性心脏病人HPSE在动脉粥样硬化斑块形成与发展中的作用以及体内HPSE表达水平对恶性肿瘤严重程度的影响。而心肌细胞凋亡和纤维化、心肌细胞肥大等心肌组织重构方面的研究比较少，尤其是对于严重影响人类健康、具有较高的再住院率和致死率的心力衰竭在发生发展过程中心肌细胞负性重构的研究少有报道。我们借助乙酰肝素酶及其相关因子在白血病中表达水平的研究经验〔20〕，采用多种研究方法，研究患者全身及血小板HPSE与心肌I/R的相关性；重点研究HPSE对心肌细胞的纤维化和凋亡的影响，探讨HPSE在心肌I/R损伤发病中的作用，及可能的分子机制，为今后心力衰竭的监测、治疗及预后评估开辟新方向，拓宽在其他领域中，HPSE阻滞剂临床应用范围，具有重要的基础及临床意义。