雨生红球藻中虾青素的研究与应用

张广伦，肖正春，张锋伦，张卫明

(南京野生植物综合利用研究院，江苏 南京 211111)

雨生红球藻(HaematococcuspluvialisFlotow)是一种单细胞淡水微藻，属绿藻门(Chlorophyta)、团藻目(Volvocales)、红球藻科(Haematococcaceae)、红球藻属(Haematococcus)。生活史中细胞具有多样性，主要有营养细胞和厚壁孢子两种形态。在弱光、氮磷丰富的环境中以游动的绿色营养细胞存在，在此状态下雨生红球藻生长旺盛，细胞内虾青素含量很低。在不利生存条件下(高光照、高温、高盐或营养盐饥饿)下失去鞭毛，以不动的厚壁孢子形态存在，并积累大量虾青素[1]。

天然虾青素的生物来源主要有虾、蟹等水产品的废弃物、红发夫酵母和雨生红球藻。其中，虾、蟹等水产品的废弃物中虾青素不仅含量低，而且提取费用高，天然红发夫酵母中虾青素的平均含量仅0.4%。雨生红球藻是天然虾青素的理想生物来源[2]。

本文主要概述了雨生红球藻中虾青素的积累规律、虾青素含量变化的影响因素，提取方法、雨生红球藻的培养方法以及虾青素的生物活性及其应用等内容，希望有助于雨生红球藻的开发利用。

1 虾青素积累过程中雨生红球藻的形态和生理变化

雨生红球藻为单细胞微藻，生活史主要分为两个阶段：绿色营养细胞(GV)阶段和不动细胞阶段。绿色营养细胞有两条鞭毛，能运动，在光下进行光合作用，在黑暗中营异养生活。不动细胞根据颜色和形态特征，又分为绿色不动细胞(GR)、桔黄色不动细胞(OR)和红色孢囊(RC)。OR细胞处于营养饥饿状态，是快速积累虾青素的时期。环境胁迫诱导形成孢囊，随着孢囊细胞成熟，类胡萝卜素大量积累。虾青素可达到细胞干重的4%～6%。

通过显微观察，OR细胞叶绿体中类囊体的膜解体成碎片状，积累大量的虾青素酯、淀粉和脂质体，这和GV细胞有很大不同。但OR细胞保留了大部分光合色素，如紫黄素(violaxanthin), 玉米黄素(antheraxanthin)和新黄素(neoxanthin)，仍能进行一定程度的光合作用，但光合效率明显下降。光合系统I和光合系统II中，能量分配类型更倾向于光合系统I(PSI)。通过OR细胞和GV细胞类囊体的蛋白质组比较分析，两者的调节蛋白均参与光合作用，但OR细胞类囊体蛋白与胁迫响应有关，而GV细胞的类囊体蛋白参与生物量积累。这些研究结果为OR细胞中虾青素的合成提供了生理依据[3]。

虾青素在雨生红球藻中是通过类异戊二烯途径合成的，合成在叶绿体外进行。起始物质为乙酰-CoA，经茄红素、番茄红素、ζ-胡萝卜素、角黄素等中间物，最后合成为虾青素。虾青素合成后，在3’-羟基酯化，增加其在细胞环境中的溶解性和稳定性。

2 虾青素及其生物活性

虾青素(astaxanthin)又名虾红素，在体内可与蛋白质结合而呈青色、蓝色。化学名称为3,3’-二羟基-β,β’-胡萝卜素-4,4’二酮，分子式：C40H52O4，相对分子质量：596.82。除了雨生红球藻和红发夫酵母(Xanthophyllomycesdendrorhous, Phaffia rhodozyma)外，近年来，发现一些绿藻也含有虾青素： 如Coelastrellastriolata、单针藻Monoraphidiumsp. 、斜生珊藻Scenedesmusobliquus、小球藻Chlorellazofingiensis等。此外，虾青素也存在于虾、蟹以及一些贝类动物体内。雨生红球藻虾青素含量较高，是提取虾青素的好原料。

虾青素具有多种生物活性[4-5]：

(1)抗氧化

虾青素具有长的共轭双键，末端酮基和羟基的活泼电子易提供电子给自由基或吸引自由基的未配对电子，从而清除自由基，起到抗氧化作用。虾青素的抗氧化作用比其它类型的类胡萝卜素更强，清除自由基的能力和淬灭单线态氧的活性比维生素E强500多倍，比玉米黄质、番茄红素、叶黄素、角黄素以及β-胡萝卜素高10倍，是花青素的17倍，被称为“超级维生素E”。虾青素强抗氧化性和清除自由基的能力，对人体健康起着极其重要的作用。

(2)增强机体免疫力

虾青素可增强T细胞，刺激人体内血细胞产生免疫球蛋白，显著增强机体的免疫功能，增加对病毒、细菌等的抵抗力。此外，其在抗原入侵初期增强特异性体液免疫反应的效果优于ζ-胡萝卜素等物质。

(3)抗衰老、抗老化

虾青素可强化机体需氧代谢，增强肌肉力量和耐受力，起到抗衰老作用。虾青素的抗氧化活性使其成为光的高效保护剂，可阻止皮肤老化，作用效果优于维生素A、β-胡萝卜素和叶黄素。虾青素脂溶性好，对细胞膜有亲和力，用虾青素开发防晒霜，不仅可防止光辐射，还有抗细胞老化的效果。

此外，虾青素有抗癌活性。

3 雨生红球藻中虾青素含量影响因素

培养雨生红球藻时，影响虾青素含量的因素是多方面的，如温度、光照强度、pH值、培养基种类以及藻种品系等，这些因素往往是协同起作用的。

(1)培养基种类、品系的影响

采用BBM、HGZ两种培养基培养雨生红球藻结果表明:BBM培养基比HGZ培养基更适合营养生长。3个品系(H17、HPM 、HPB)的平均生长速率分别提高57.2%、28.97%、18.1%。培养10 d,叶绿素含量增加201.9%～288.2% ，干重增加38.8%～114.3%；而HGZ培养基更适合虾青素积累。在强光和缺氮条件培养15 d后,用HGZ培养基培养的3个红球藻品系细胞的虾青素累积为BBM培养基的2.0～2.5倍[6]。

邱保胜等对传统培养基作了改良，保持了绿色游动细胞培养期pH值的相对稳定，可培养出高密度绿色营养细胞[7]。

(2)接种密度、pH值

将pH值控制在偏碱性条件下(7.75±0.10)，有利于藻细胞生长；较高的接种密度(2.3×104个/mL)能缩短营养培养周期(7 d),接种密度变化对胁迫周期长短无明显影响(均为4 d),所以选用较高的接种密度可望降低花青素工业生产的成本。

(3)氮磷等营养因素

在BBM培养基中NaNO3浓度减半时(0.13 g/L),细胞增殖及色素累积都相对有利。在高光强下实施氮、磷饥饿,红球藻细胞分裂明显受抑,但色素的累积作用增强,培养9 d,细胞内次生类胡萝卜素的含量分别比对照组提高141.0%和60.5%,色素的累积高峰也比对照组提前2～4 d。因此，在培养适当时机控制氮磷的量，特别是氮素，对提高虾青素含量有利[8]。

氮素种类对雨生红球藻生长和虾青素积累的影响也有不同。雨生红球藻797株以NH4+-N培养的生长速率明显高于NO3--N培养,平均生长速率分别为0.279 m/d和0.190 m/d，且NH4+-N培养所消耗的N、P营养盐比NO3--N培养消耗的少。两种氮源下强光照处理1 d和7d均导致雨生红球藻细胞数减少而静细胞比例增加。在虾青素合成阶段,藻液N含量急剧下降而P含量基本保持稳定,说明虾青素合成对N的需要量大而对P的需要小。在NH4+-N培养下SOD活性下降而虾青素含量升高，而在NO3--N培养下SOD活性与虾青素含量同时升高。

(4)光照和碳源

不同光照强度及添加不同葡萄糖量进行混合培养对雨生血球藻虾青素产量的影响研究表明,单位体积培养液虾青素产量随光照强度和葡萄糖添加量变化,在光照强度为2 500 lx以及葡萄糖添加量为3 g/L时,虾青素产量最高。光照强度和葡萄糖添加浓度对虾青素产量有交互影响。通过中心组合试验,混合培养条件下最高虾青素产量所需要的葡萄糖添加量及光照强度分别为3.161 6 g/L和2 605.66 lx。此时的虾青素产量为41.06mg/L,是自养培养时的2.02倍[9]。

(5)温度

在环形培养池模拟系统培养雨生红球藻,观察温度对雨生红球藻生物量及虾青素产量的影响。结果表明,在15 ℃～25 ℃的范围内,不同温度下雨生红球藻生物量和虾青素含量及产量都经历了一个上升-最高-下降的过程。25 ℃与22 ℃时红球藻的虾青素产量、虾青素含量(干重)均显著高于其他温度(P<0.01)。15 ℃时,红球藻生物量、虾青素含量和虾青素产量均最低,分别为1.4 g、0.54%和 2.49 mg/L;25℃时,红球藻生物量和虾青素产量最高,分别为2.68 g和13.53 mg/L;22 ℃时,虾青素含量最高,为1.52%[10]。

(6)光照

光照是诱导虾青素积累的重要因子。高光照强度有利于虾青素积累而不利于生长，但光照过强会导致红球藻大量死亡。一般认为，2 klx以下的弱光有利于红球藻营养细胞的生长，最佳光强为1.1～1.3 klx。红光可促进雨生红球藻的生长。虾青素积累的最适光强范围为34.4～36.6 klx,雨生红球藻置于10～12 klx光强下，营养细胞迅速由绿色变为红色。蓝光比红光更有利于红球藻合成虾青素[11]。

也有试验认为，光照强度10～12 klx有利于绿色营养细胞转化为红色细胞[12]。

(7)碳氮比

在低C/N的营养培养基中雨生红球藻营养生长期延长，长势旺盛，而高C/N的培养基中易形成孢囊，虾青素含量也高[13]。

4 雨生红球藻培养方法

根据雨生红球藻的不同存在形式，一般将虾青素的生产分成微藻培育和虾青素积累两个阶段。第一阶段让营养细胞高密度生长。第二阶段中，通过高温、增加光强度、提高盐浓度等手段，促使营养细胞转变成厚壁孢子，达到积累虾青素的目的。雨生红球藻的培养主要有以下方式：

分批培养(batch culture)。用少量藻液接种，培养一段时间，当细胞生长繁殖达到较高的密度，进行采收或进一步扩大培养。将收获的的培养物胁迫处理获得虾青素。分批培养是传统培养方式，耗时长、产量低，不适合大规模培养。

半连续培养(semi-continuous culture)。在分批培养的基础上，当藻细胞达到一定浓度后，每次收获一部分藻液，同时补充等量的培养液，继续培养。待培养物达到一定浓度后，再次收获并补充培养液，如此循环。

根据雨生红球藻生长特点，采用连续异养-光合自养培养法对雨生红球藻进行培养，可得到高产量的虾青素。方法是先用异养方法培养细胞，使其达到很高的细胞浓度，再采用光培养积累虾青素。异养阶段生物量形成的最适pH值为8，温度为25 ℃。醋酸盐在10～30 mmol/L的浓度范围内变化对细胞的比生长速率没有明显影响。但高浓度的醋酸盐抑制细胞生长。因此异养培养阶段以醋酸盐为有机碳源时，可用流加培养法保持pH值稳定，可获得质量浓度高达7 g/L的细胞。异养培养期间由于细胞从营养到孢囊转变，要想得到更高浓度的细胞似乎不大可能。但反复流加培养，可让细胞维持在生长型，获得2倍多的数量的细胞。用连续异养-光合自养培养法可获得114 mg/L的虾青素，生产率为4.4 mg/(dL)[14]。

利用红发夫酵母细胞吸收利用雨生红球藻代谢过程中产生的NH4+的特点，可让两者混合培养，稳定pH值在7.0左右，使雨生红球藻碳代谢在虾青素合成方向占优势，提高虾青素产量[15]。

目前，光生物反应器已普遍应用于微藻培养，有开放式和封闭式两大类。封闭式光生物反应器有管道式、平板式、柱状气升式、搅拌式等，主要用于雨生红球藻原藻液培养和扩种培养。开放式具有投资少、成本低、技术要求简单的特点，用于雨生红球藻规模化绿色细胞高密度培养和虾青素积累期孢子培养。据报道，在最佳培养条件下，雨生红球藻细胞接种1 d后即进入指数生长阶段,在胁迫阶段仅需4 d即达到虾青素含量的峰值[16-17]。

5 虾青素的提取方法

虾青素在雨生红球藻红色孢囊内，壁厚且坚硬，需经研磨法、微波法、高压均质等方法破壁处理。根据虾青素脂溶性的特点，用乙酸乙酯、乙醇、丙酮等有机溶剂提取。

考察匀浆法等5种破壁方法对虾青素提取率影响的结果表明,对雨生红球藻最佳破壁条件:匀浆法破壁时间22 min,水为介质;冻融温差法破壁温度为-70 ℃,时间为12 h,冻融2次,水为介质;超声功率400 W,每次超声时间5 s,共超声25 min;直接研磨法研磨时间1 min;加液氮低温研磨法破壁2次,每次时间0.5 min;虾青素的提取率依次为0.76%、0.93%、1.03%、1.51%和3.21%。加液氮低温研磨法在破壁过程中不添加化学试剂,不产生污染,能最大限度地保留虾青素的生理活性,是所选方法中最好的[18]，但所需成本较高。

陈兴才等研究了几种物理破壁法对雨生红球藻厚壁孢子细胞破壁率及虾青素提取率的影响,确定了高压均质处理、超声波法和反复冻融法的最适工艺条件。试验结果表明:高压均质处理最适合于雨生红球藻厚壁孢子的破碎和虾青素的提取。优化条件为:40 MPa,室温,循环3次,破壁率可达91.4%,虾青素提取率为28.02μg/mg(细胞干重),而未经破壁的虾青素提取率仅为17.92μg/mg(细胞干重),提取率提高了56.3%[19]。

对微波萃取研究结果表明：萃取时间4.5 min,萃取功率540 W,液料比220:1的条件下,虾青素的提取率最佳,可达1.020%[20]。

(1)溶剂提取法。以冻干的雨生红球藻粉为原料,采用乙醇和乙酸乙酯混合溶剂进行虾青素酯的提取。L9(33)正交试验筛选获得虾青素酯的最佳条件:温度25 ℃,提取时间为6 h,乙酸乙酯和乙醇的配比为1:2,固液比为1:120(g/mL)。对提取的虾青素酯进行皂化,分别研究了4 ℃和40 ℃时碱的浓度及皂化时间对提取效果的影响。结果表明:0.06 mol/L KOH-甲醇溶液于4 ℃皂化12 h效果最好,从100 mg藻粉可以得到(575.86±5.68)μg虾青素单体[21]。

(2)超临界流体萃取法。以雨生红球藻粉为原料,采用超临界CO2萃取技术,萃取雨生红球藻浸膏,最佳工艺条件为：萃取压力44.6 MPa，萃取温度64.2 ℃。CO2流速7.1 L/h，萃取时间3.5 h,在此条件下获得的虾青素提取率可达1.028%[11]。

6 虾青素的应用

雨生红球藻在自然界生活在池塘湖泊中，是鱼、虾、蟹、贝类等水产的天然食物来源，参与生态系统的物质循环和能量代谢。通过培养雨生红球藻，获得的虾青素可应用于食品、保健品、化妆品、医药等多领域。

6.1 食品添加剂

虾青素有很强的抗氧化作用，可用于食品保鲜，延长食品货架期。对南湾鳙鱼油抗氧化性能测试结果表明：鱼油中添加虾青素可明显抑制酸价和过氧化值上升。虾青素抗氧化性能优于油溶性茶多酚，并优于维生素E。虾青素联合茶多酚抗氧化作用更为明显，对南湾鳙鱼油的抗氧化作用与TBHQ(叔丁基对苯二酚)相当。0.02%虾青素+0.02%茶多酚的复合抗氧化剂可使南湾鳙鱼油在20 ℃条件下的预期贮藏期从20 d 延长到120 d。虾青素作为新型天然抗氧化剂用于食品越来越受到青睐[22]。

6.2 在保健品中的应用[23-24]

虾青素可用于多种功能保健品的开发，如增强免疫力，抗氧化、缓解视疲劳、保护胃粘膜等。

(1)虾青素能防止脂质过氧化，是单线态氧的淬灭剂，清除自由基，延缓衰老。Tinkler等研究了几种类胡萝卜素对体外血细胞淬灭单线态氧的效率，其中虾青素比β-胡萝卜素高，仅次于番茄红素。虾青素清除自由基的效率比β-胡萝卜素和玉米黄质高50%。

(2)虾青素可增强动物的免疫功能。促进脾细胞产生抗体，增强T细胞刺激下人体内血细胞免疫球蛋白的产生。动物试验表明，虾青素能增强小鼠释放白细胞介素-1α和肿瘤坏死因子α，其作用比β-胡萝卜素和角黄素强。

(3)虾青素对视力有保护作用，可预防和减轻眼疲劳。Jyonoychi等报道虾青素可有效防止人视网膜氧化和感光细胞损伤，改善视网膜功能[25]。Lennikov用小鼠实验表明虾青素可预防或治疗紫外线诱导的角膜炎[26]。Cort也证实虾青素对高眼压大鼠视网膜有保护作用[27]。

(4)对慢性胃炎研究表明，虾青素提取物通过抗氧化作用能保护小鼠的胃黏膜免受损伤，对溃疡形成有抑制作用。Bennedsen等证实虾青素可减少细菌侵入，减轻胃炎症，并通过淋巴细胞释放因子抗小鼠幽门螺旋菌感染[28]。

此外，Lingnell等研究发现口服虾青素可明显增强人的肌肉力量和耐受力。

6.3 在医药领域的应用[23-24]

(1)抗癌

动物实验模型证实,虾青素能显著抑制肿瘤生长、诱导细胞凋亡、抑制癌细胞转移。其作用机制不仅与其抗氧化作用有关,还可能通过活化过氧化物酶体增殖物激活受体γ (PPARγ),抑制NF-κB激活等调控多种信号分子实现其抑癌作用。虾青素可有效抑制胃癌、肝癌等[29]。

(2)防治心脑血管疾病

Choi等观察了虾青素对肥胖人群的血脂和氧化应激的影响：服用虾青素后低密度脂蛋白、载脂蛋白B等指标都显著降低。Sasaki等用大鼠所做的实验证实虾青素具有抗血栓和抗高血压的作用。因此，虾青素可用于防止心脑血管疾病。

(3)预防糖尿病及肾病

Chan研究表明虾青素能减弱糖尿病所导致的血凝、氧化应激以及炎症反应。Naito等研究了虾青素对小鼠肾病的预防效果，结果显示虾青素的抗氧化作用减少了肾病的氧化应激并能防止肾细胞损伤。虾青素有望用于糖尿病和肾病治疗。

6.4 化妆品

虾青素脂溶性好，对细胞膜具有亲和力，抗氧化活性强于维生素E，可用于新型化妆品的开发。目前，不少品牌的化妆品均把雨生红球藻提取物作为配方成分，包括日本品牌高丝(KOSE)、芳凯(Fancl)、姿姿(JUJU)等都推出了雨生红球藻提取物系列保湿霜、抗皱眼霜、面膜等。我国用虾青素为原料生产的抗氧化眼霜、眼贴、洁面乳等产品也已问世。

6.5 饲料

多数动物都不能合成类胡萝卜素，虾青素作为饲料添加剂能显著改善动物的体色，促进生长，增强机体免疫力，提高营养价值和商品价值。

北极红点鲑饲料中添加虾青素，肌肉的红色程度与添加虾青素的量呈正相关。虹鳟鱼饲料中添加100 mg/L的虾青素可使肌肉中的类胡萝卜素含量大幅度升高。雨生红球藻虾青素对血鹦鹉观赏鱼的生长、着色及抗氧化能力试验结果表明：喂食添加虾青素饲料的实验组鱼体增重300%，较对照组提高50%；鱼皮肤中虾青素、类胡萝卜素含量分别是实验前的174%、184%；鳞片中虾青素、类胡萝卜素含量为实验前的207%、256%，鱼肌肉总抗氧化能力显著高于对照组。用虾青素喂养鸡鸭，可生产出天然色素红心蛋。

7 展 望

虾青素卓越的抗氧化性能令人瞩目，目前已有日本的YAMAHA集团、FUJI化学集团、Biogenic公司、美国Cyanotech公司、印度BioPrex公司、以色列Algatech公司规模化养殖红球藻生产天然虾青素。我国在商业化养殖红球藻也取得突破。湖北一家公司在荆州已建成2.4万m2的雨生红球藻培养池，年产虾青素含量2.0%以上雨生红球藻粉10～25 t[30]。2010年卫生部批准雨生红球藻为新资源食品之一。除了含有类胡萝卜素外，雨生红球藻还含有蛋白质(23.62%)、 碳水化合物 (38.0%)、脂肪(13.80%)，铁、镁、钙等矿物质以及叶酸、烟酸、泛酸等维生素，本身就有较高的营养价值[31]。可根据产品功能定位和消费人群的不同，直接加工成藻粉或深加工成虾青素提取物。对雨生红球藻培养废水综合利用也是一项重要课题，如从中提取活性胞外多糖等。在挪威斯瓦尔巴特(Svalbard)群岛已发现在4～10 ℃生长的耐寒新品系[32]，加强雨生红球藻低温品种的引种培育，让更广阔的地区实现其规模化生产已刻不容缓。