6个枇杷品种对低温胁迫的生理响应及抗寒性评价

潘翠萍 谢红江 王永清 张卉 邓群仙 杨志武 文露 何珊珊

摘  要  为探究枇杷对低温胁迫的生理响应，综合评价不同枇杷品种的抗寒能力，本研究以6个枇杷品种为试验材料，研究了低温胁迫对枇杷幼果种胚相对电导率、丙二醛、脯氨酸、可溶性糖和可溶性蛋白含量的变化。结果表明：随处理温度的降低，各枇杷品种幼果种胚相对电导率REC呈现“小大小”的“S”型曲线变化，结合Logistic方程得出不同枇杷品种种胚的半致死温度介于4.759 ～ 2.73 ℃之间，其中，WT（白肉芽变）幼果种胚的半致死温度最低，大五星幼果种胚的半致死温度最高;6个枇杷品种的脯氨酸（Pro）含量、丙二醛（MDA）含量随低温胁迫均呈现出先升高后降低的倒“V”型变化趋势，但增幅和达到峰值的时间点不同;可溶性糖和可溶性蛋白含量呈逐渐增加的趋势，均在5 ℃时达到最大值;通过隶属函数综合分析，得出6个枇杷品种材料的抗寒能力表现为WT（白肉芽变）>冠玉>宁海白>龙泉5号>早钟6号>大五星。综上所述，WT（白肉芽变）对低温的胁迫具有较强的适应性，抗寒能力强;半致死温度LT50结合隶属函数法的综合评价能准确鉴定枇杷品种的抗寒性。本研究为枇杷抗寒种质的筛选及寻找提高抗寒性的新途径提供理论依据。

关键词  枇杷;低温胁迫;生理响应;抗寒性;评价

中图分类号  S667.3      文獻标识码  A

Physiological Responses and Evaluation of Cold Resistance under Cold Stress for Six Varieties of Eriobotrya japonica （Thunb.）

PAN Cuiping1， XIE Hongjiang2， WANG Yongqing1*， ZHANG Hui1， DENG Qunxian1， YANG Zhiwu1，

WEN Lu1， HE Shanshan1

1. College of Horticulture， Sichuan Agricultural University， Wenjiang， Sichuan 611130， China; 2. Horticulture Institute， Sichuan Academy of Agricultural Sciences， Chengdu， Sichuan 610066， China

Abstract  In order to investigate the physiological response and comprehensively assess cold resistance of different varieties under low stress， six varieties of Eriobotrya japonica （Thunb.） under cold stress were analyzed to determine the dynamic changes of relative electric conductivity （REC）， malonadehyde （MDA）， free proline （Pro）， soluble sugar and soluble protein. The results showed that the relative electric conductivity （REC） in vitro seed embryos of young fruits of six loquat varieties presented an ‘S type curve change pattern as temperature decreased. The semi-lethal temperature of the six loquat varieties ranging from 4.759 to –2.73 ℃ using logistic equation， the semi-lethal temperature of white bud mutation was the highest and the Dawuxing loquat was the lowest among them. The contents of free proline （Pro） and malonadehyde （MDA） presented an inverted “V” type curve change pattern with the different time point of reaching the peak， which generally increased first and then decreased under cold stress. Furthermore， the soluble sugar and soluble protein increased as temperature decreased with the maximum value was obtained at the time of 24 h when treated at 5 ℃. The cold resistance ability of the six loquat varieties evaluated as WT （white bud mutation） > Guanyu > Ninghaibai > Longquan No.5 > Zaozhong No.6 > Dawuxing. In conclusion， the WT （white bud mutation） showed strong adaptability to low temperature stress and strong cold resistance. The median-lethal temperature combined with comprehensive evaluation based on subordinate function analysis could accurately identify the cold resistance of loquat varieties， which would provide a theoretical foundation and reference for screening of cold materials and looking for a new approach to increase the cold hardiness of loquat.

Keywords  loquat （Eriobotrya japonica （Thunb.） Lindl.）; cold stress; physiological responses; cold resistance; evaluation

DOI  10.3969/j.issn.1000-2561.2019.12.009

枇杷（Eriobotrya japonica （Thunb.） Lindl.）隶属于蔷薇科（Rosaceae）枇杷属（Eriobotrya），是我国南方主要经济树种和名贵特产果树之一[1-2]，枇杷原产我国西南（四川雅安境内大渡河流域），已有2100多年的栽培历史;我国是世界枇杷的自然分布中心和栽培中心[3-4]。四川是枇杷的栽培大省，栽培面积4万hm2，产量40万t，其栽培面积和产量均居全国第一。枇杷已成为四川最具特色和竞争优势的亚热带果品之一，在推动四川盆周山区农村经济发展、产业结构调整和农民增收致富中占有重要地位[5]。

枇杷秋萌冬花，春实夏熟，以幼果越冬，极易遭受冻害[6-8]。据统计，四川枇杷产区在2008— 2018年间因低温造成减产的面积超过总栽培面积的60%，严重影响枇杷产业发展产，2016年全省枇杷受冻面积达90%以上，几近绝收。冻害已成为一些产区产业持续发展的主要制约因素，严重影响了果农的经济效益[9]。

前人对枇杷抗寒性研究多以叶片和果实为研究材料[10-12]，以幼果种胚为研究材料的较少，且前人多采用离体胁迫的方式[13]，以整个植株为胁迫对象的较少[14];然而，枇杷幼果受冻表现为种子最先受冻褐变，进而引起幼果受冻致死。因此，研究种胚在低温胁迫下的生理响应对于准确评价枇杷材料的抗寒性能具有重要意义。本研究分析了6个枇杷品种幼果种胚在低温胁迫下的生理响应，采用隶属函数法对其抗寒性能进行了综合评价，以期为枇杷抗寒新品种的选育及寻找提高枇杷抗寒性的新途径提供理论依据。

1  材料与方法

1.1  材料

供试的6个枇杷品种分别为冠玉、宁海白、大五星、龙泉5号、早钟6号，WT（白肉芽变），所有材料均为3年生盆栽嫁接苗，砧木为解放钟;选择长势基本一致，高度为80～90 cm、幼果直径大小为1.2～1.3 cm的挂果盆栽为试材。

1.2  方法

1.2.1  低温胁迫  将盆栽苗进行梯度降温后（降温速度为4 ℃/h），分别进行不同温度（3 ℃、1 ℃、1 ℃、3 ℃、5 ℃），每个温度梯度均处理24 h，以25 ℃为对照，1 ℃处理置于人工气候箱（光照时间9 h/d，光照强度为3000 lx，空气湿度60%）。1 ℃、3 ℃、5 ℃处理置于低温植物培养箱中进行（其精确度为±1 ℃，空气湿度、光照时间和强度同人工气候箱处理相一致），每个温度梯度处理5盆，重复3次。盆栽苗经预设低温处理后室温恢复12 h，分别选取不同处理后直径大小为1.2～1.3 cm幼果，手术刀冰面上迅速切取幼果种胚，液氮速冻后超低温保存进行相关生理指标测定。

1.2.2  半致死温度LT50的测定  相对电导率的测定方法参照赖静[9]的方法进行，REC和Logistic方程配合，计算种胚的半致死温度LT50[15]。

1.2.3  生理指标的测定  细胞膜透性采用电导率法，REC和Logistic方程配合，计算种胚的半致死温度LT50;丙二醛（MDA）的测定采用硫代巴比妥酸法;超氧化物歧化酶（SOD）测定采用抑制光化还原法;过氧化氢酶（CAT）测定采用高锰酸钾滴定法;过氧化物酶（POD）测定采用愈创木酚法;可溶性糖（SS）含量用蒽酮比色法测定;可溶性蛋白（SP）含量采用考马斯亮蓝法测定。

1.2.4  抗寒性综合评价  采用隶属函数法综合各项指标对枇杷材料进行抗寒性评价[16]。

1.3  数据处理

采用DPS 7.05軟件对实验数据进行方差分析和差异显著性检验。

2  结果与分析

2.1  低温胁迫下枇杷幼果种胚的相对电导率变化与半致死温度

随处理温度的降低，各枇杷品种幼果种胚相对电导率REC呈现“小大小”的“S”型曲线变化（图1），不同枇杷品种对低温胁迫的敏感性不同，当处理温度从3 ℃降到1 ℃时，WT、冠玉、宁海白相对电导率分别增加了4.7%、7.6%、12.5%，而红肉枇杷龙泉5号、早钟6号、大五星相对电导率分别增加了18.7%、28.1%、36.4%。当温度降至3 ℃时，WT、冠玉、宁海白相对电导率分别为59.32%、67.32/%、70.21%，而龙泉 5号、早钟6号、大五星相对电导率均超过了80%，当处理温度为5 ℃时，早钟6号、大五星相对电导率分别为88.39%、89.54%，显著高于其他4个品种，WT相对电导率最低，为65.21%，根据电导率大小与植物抗寒性的关系可知，WT的抗寒能力强，大五星的抗寒能力最弱。

Logistic方程拟合结果显示，6个枇杷品种种胚相对电导率与半致死温度LT50呈较强的线性关系，R2介于0.907～0.946之间，表明拟合结果较精确可靠，可作为枇杷抗寒性判定的重要指标（表1）。不同枇杷品种种胚的半致死温度介于4.759～2.73 ℃之间，其中，WT幼果种胚的半致死温度最低，抗寒能力强，大五星幼果种胚的半致死温度最高，抗寒能力弱。

2.2  低温胁迫下枇杷种胚的生理响应特征

低温胁迫下，6个枇杷丙二醛含量呈现出先升高后降低的倒“V”型变化趋势，但增幅和达到峰值的时间点不同（图2），龙泉5号、早钟6号、大五星丙二醛含量在处理胁迫温度为1 ℃时达到最大值，其中大五星丙二醛含量最高，达0.92 nmol/g，冠玉、宁海白在3 ℃时达到最大值，而WT在处理温度为5 ℃时达到最大值。在整个低温胁迫3 ℃降到5 ℃时过程中，大五星丙二醛含量变幅最大，其次为早钟6号，WT丙二醛变幅最小。

6个枇杷品种低温胁迫下脯氨酸含量（图3）变化规律与MDA类似，低温处理初期，脯氨酸含量急剧上升，随着处理时间延长脯氨酸含量又逐渐降低。龙泉5号、早钟6号、大五星脯氨酸在1 ℃时达到最大值，相比3 ℃时增幅分别为92%、60.7%、75%;冠玉、宁海白、WT脯氨酸在3 ℃时达到最大值，相比3 ℃时其增幅分别为106.9%、91.6%、98.5%。WT脯氨酸含量在低温胁迫过程中始终处于较高水平且增幅较大。

随着处理温度的降低，6个枇杷品种的可溶性糖含量呈逐渐增加的趋势，均在5 ℃时达到最大值，其中早钟6号和大五星的增幅相对较小，分别为88.3%和98.1%，而WT的可溶性蛋白增幅最大，达141.6%（图4）。可溶性蛋白含量与可溶性糖含量具有相似的变化规律（图5），也是随着处理温度的降低呈上升的趋势，在低温胁迫初期（3 ℃）时，可溶性蛋白含量基数白肉品种冠玉、宁海白、WT显著高于红肉品种龙泉5号、早钟6号、大五星，在5 ℃时达到最大值时，可溶性蛋白含量白肉品种冠玉、宁海白、WT分别较3 ℃时增加了132.5%、111.8%、101.1%、黄肉品种龙泉5号、早钟6号、大五星分别增加了139.3%、138.5%和166.7%。

2.3  抗寒性综合评价和聚类分析

采用隶属函数法对6个枇杷的5项生理指标进行抗寒性综合评价，结果表明（表2），WT、宁海白、冠玉、早钟6号、龙泉5号及大五星的平均隶属度分别为0.759、0.556、0.592、0.434、0.474、0.407，平均隶属度综合反映了品种抗寒能力的大小，其值越大则表明抗寒性越强。因此，

低温胁迫下6个枇杷品种的抗寒能力大小依次为WT>冠玉>宁海白>龙泉5号>早钟6号>大五星。

对6个枇杷的抗寒平均隶属函数值进行聚类分析（图6），可将6个枇杷品种分为3类。第一类：WT，抗寒能力强;第二类：冠玉>宁海白，抗寒能力中等;第三类：龙泉5号>早钟6号>大五星，抗寒能力较弱。这与半致死温度LT50得出的结果基本一致。

3  讨论

植物膜系统是植物受低温伤害的原发部位，其稳定性对于植物抵御低温逆境具有重要意义。相对电导率的变化反应细胞膜透性的改变，因此常作为评定植物细胞膜损坏程度的重要参考指标[17]。前人研究表明，抗寒能力强的植物低温胁迫下植物膜系统稳定性较强，相对电导率较小，反之，植物膜系统稳定性较差，相对电导率较大[18]。本研究表明，随处理温度的降低，6个枇杷品种幼果种胚相对电导率REC呈现“小大小”的“S”型变化趋势，表明各枇杷品种随着低温胁迫的加剧，种胚细胞膜系统均受到不同程度的伤害。不同枇杷品种对低温胁迫的敏感性不同，当处理温度为5 ℃时，大五星相对电导率最高，为89.54%，而WT相对电导率最低，为65.21%，根据电导率大小与植物抗寒性的关系可知，WT的抗寒能力最強，大五星的抗寒能力最弱，这与Logistic方程的拟合结果一致。

丙二醛可用于反映植物细胞膜伤害程度及抵御逆境能力的强弱[19-20]。令凡等[21]对低温胁迫下油橄榄相关生理特征的变化研究表明，油橄榄抗寒性与树体中丙二醛含量呈负相关，即抗寒性越强的植物丙二醛含量变化越小。本研究中，MDA含量随低温胁迫总体呈上升的趋势，表明膜脂过氧化程度加剧，LT50较高的的大五星丙二醛含量变幅最大，而LT50较低的WT丙二醛变幅最小，说明WT在低温胁迫中过氧化程度弱，表现出较高清除ROS的能力和较强的抗寒能力。

脯氨酸、可溶性糖及可溶性蛋白是植物内重要的渗透调节物质[22-23]，是植物抗寒性鉴定的重要生理指标[24]。本研究结果显示，6个枇杷材料的脯氨酸含量随低温胁迫均呈现出先升高后降低的倒“V”型变化趋势，LT50较低的WT脯氨酸含量在低温胁迫过程中始终处于较高水平且增幅较大，说明低温胁迫中脯氨酸积累越多，植物的抗寒能力越强，当低温加剧致使其酶系统损坏时，种胚中脯氨酸能力降低，脯氨酸含量下降。随着低温胁迫的加剧，6个枇杷材料种胚中可溶性糖及可溶性蛋白含量则呈现逐渐增加并趋于平稳的态势，这与针对柑橘[25]、葡萄[26]、火龙果[27]、草莓[28]等果树的研究结果一致。在整个胁迫过程中3种渗透调节物质变幅均较为明显，表明枇杷种胚中脯氨酸、可溶性糖及可溶性蛋白对低温较为敏感，对枇杷抵御低温逆境具有重要的调节作用。

植物的抗寒性受生理生化特征遗传表现的综合作用，因此，单一抗寒指标难于判断植物对低温的综合适应能力[22]，本研究采用隶属函数法对6个枇杷的5项生理指标进行抗寒性综合评价，表明6个枇杷品种的抗寒能力大小依次为WT>冠玉>宁海白>龙泉5号>早钟6号>大五星。该结果与单独运用半致死温度LT50评价枇杷的抗寒结果一致，表明半致死温度LT50结合隶属函数法的综合评价能较为准确鉴定枇杷品种的抗寒性。

4  结论

低温胁迫下，6个枇杷品种的生理响应存在显著的差异性，枇杷品种幼果种胚相对电导率REC呈现“小大小”的“S”型曲线变化;Pro含量、MDA含量随低温胁迫均呈现出先升高后降低的倒“V”型变化趋势;可溶性糖和可溶性蛋白含量呈逐渐增加的趋势。WT对低温的胁迫具有较强的适应性，抗寒能力强，半致死温度LT50结合隶属函数法的综合评价能准确鉴定枇杷品种的抗寒性，为枇杷抗寒种质的筛选及寻找提高抗寒性的新途径提供理论依据。

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