ClO2对猕猴桃表面溃疡病病菌的杀菌作用及果实货架期品质的影响

曹 凡 高贵田 王 铎 雷玉山 赵武奇

(1陕西师范大学食品工程与营养科学学院，陕西西安 710119；2陕西省农村科技开发中心，陕西西安 710054；3陕西省猕猴桃工程技术研究中心，陕西西安 710404)

猕猴桃细菌性溃疡病(kiwifruit bacterial canker)是由丁香假单胞杆菌猕猴桃致病变种(Pseudomonas syringaepv.actinidiae，Psa)引起的一种毁灭性病害[1-4]。感染Psa的植株，无有效药彻底根治，只能挖树毁园，严重限制了猕猴桃产业的发展。世界猕猴桃产区新西兰[5]、西班牙[6]、意大利[7]、土耳其[8]等地均发生过猕猴桃溃疡病，中国猕猴桃主产区陕西周至、眉县、户县等地区溃疡病危害也比较严重[9-10]。Gallelli等[11]从无症状的猕猴桃果实表面检测到Psa；朱丹等[12]采用巢式PCR方法检测陕西猕猴桃产区冷库中成熟的猕猴桃果实表面Psa，发现4个猕猴桃贮藏库抽取的40个猕猴桃果实样品中有8个样品检测结果为阳性。Psa虽然不是人和动物的致病微生物，也不能感染成熟的猕猴桃果实，但附着在果实表面的Psa会随着猕猴桃的运输、销售进行扩散、传播，给猕猴桃Psa的防治带来了较大困难。2015年我国从新西兰、意大利等国进口猕猴桃近14万t，出口270 t，进出口猕猴桃可能成为Psa世界范围远距离传播的途径[13]。因此，研究如何有效杀灭猕猴桃果实表面的Psa，对防止Psa在国际上及国内不同产区之间的传播，减少猕猴桃溃疡病的发生具有重要意义。

目前主要采用生物防治[14]和化学防治[15]等方法防治Psa，其中，化学防治常用药剂为氢氧化铜、叶枯唑、农用硫酸链霉素、中生菌素、噻霉酮、可杀得、加瑞农、春雷霉素等[16]。这些化学药剂对猕猴桃Psa的治疗具有较好的疗效，但长期大量使用会使植物产生抗药性[17-18]，同时导致猕猴桃果实农残超标，影响果品质量安全。二氧化氯(ClO2)是一种高效、广谱、安全无残留的绿色消毒剂。美国食品药品监督管理局于1988年批准将ClO2应用于果蔬的清洗剂[19]。ClO2具有较强的氧化性，不仅可以杀死一般的细菌，而且对病毒、真菌、芽孢也有杀灭能力[20]。王亚萍等[21]研究表明猕猴桃采后适宜浓度的ClO2处理能显著抑制可滴定酸含量、可溶性糖含量和Vc含量的下降速率；薛敏等[22]研究发现气体ClO2可以有效延缓华优猕猴桃果实硬度的下降，抑制果实呼吸速率和过氧化物酶活性，保持果实贮藏品质；田红炎等[23]研究发现ClO2处理可降低机械损伤猕猴桃的呼吸速率、乙烯释放速率和腐烂指数，具有明显的防腐保鲜效果。目前，有关ClO2杀灭猕猴桃果实表面Psa的研究较少，本研究采用不同浓度的ClO2溶液对Psa进行处理，获得ClO2溶液对Psa的最佳杀菌条件，出库时用最佳杀菌条件处理猕猴桃果实，分析不同浓度的ClO2溶液处理对猕猴桃果实货架期品质的影响，以期确定既能有效杀灭猕猴桃果实表面Psa又能保持果实货架期品质的处理条件，为控制猕猴桃果实Psa传播及保持果实货架期品质提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

猕猴桃果实，品种为海沃德，购自陕西佰瑞猕猴桃研究有限公司，已在冷库(0℃、相对湿度85%～90%)贮藏110 d；猕猴桃溃疡病病原菌，西北农林科技大学黄丽丽教授惠赠；ClO2缓释剂(纯度8%)，购自天津市张大科技发展有限公司；蛋白胨、琼脂等试剂均购自天津市天力化学试剂有限公司。

磷酸缓冲盐:A 液:7.16%Na2HPO4·12H2O，B液:3.12%NaH2PO4·2H2O，将 A 液与 B 液以 1∶9比例混合，得到0.2 mol·L-1磷酸缓冲盐溶液，调节pH值至5.9；中和剂:准确称取5 g硫代硫酸钠晶体与20 mL吐温80加热溶于1 000 mL磷酸缓冲液；King′s B培养基:2 g 蛋白胨、0.15 g MgSO4·7H2O、0.15 g K2HPO4、1 mL甘油、1.5 g琼脂(液体培养基不加琼脂)，加蒸馏水至100 mL，调节PH值至7.4，121℃灭菌20 min，置于4℃保存备用。

1.2 主要仪器与设备

LDZX-30KBS立式压力蒸汽灭菌锅，上海申安医疗器械厂；THZ-C恒温振荡器，太仓市实验器械设备厂；HWS智能型恒温恒湿培养箱，宁波江南仪器厂；GY-3果蔬硬度计，浙江托普仪器有限公司；PAL-1型折光仪，广州市爱宕科学仪器有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 Psa菌悬液的制备 将保存的Psa甘油菌用灭菌的接种环平板划线法在固体培养基上培养，24℃恒温培养3 d，挑取单菌落，接种于已灭菌的液体培养基中，24℃、200 r·min-1恒温振荡器中过夜培养 12 h，调菌悬液浓度为106cfu·mL-1。

1.3.2 ClO2溶液对Psa杀菌效果的研究

1.3.2.1 ClO2浓度对Psa杀菌效果的影响 准确配置 ClO2浓度梯度为 20、80、140、200、240 mg·L-1，分别加入2 mL Psa菌悬液于2 mL不同浓度梯度的ClO2溶液中，充分混匀，使混合液中ClO2溶液的最终浓度分别为 10、40、70、100、120 mg·L-1，处理时间为 4 min，pH值4。对照组加入灭菌蒸馏水。

1.3.2.2 处理时间对Psa杀菌效果的影响 分别加入2 mL Psa菌悬液于2 mL 70 mg·L-1的ClO2溶液中，充分混匀，调节pH值至4，处理时间分别为2、4、6、8、10 min。对照组加入灭菌蒸馏水。

1.3.2.3 pH值对Psa杀菌效果的影响 分别加入2 mL Psa菌悬液于2 mL 70 mg·L-1的ClO2溶液中，调节pH 值分别为 2、4、6、8、10，充分混匀，处理 4 min。 对照组加入灭菌蒸馏水。

1.3.2.4 Psa杀菌率的计算 ClO2溶液与菌液处理结束后，吸取4 mL中和剂分别与1 mL混合液中和10 min，然后分别吸取100 μL最终液涂布于固体培养基，置于24℃恒温恒湿培养箱中培养3 d，统计单菌落数。每组重复3次。按照公式计算杀菌率[24]:

1.3.2.5 ClO2溶液对Psa杀菌效果条件的优化 采用响应曲面试验设计法[25]研究ClO2溶液对Psa的杀菌条件。选取溶液浓度(X1)、处理时间(X2)和溶液pH(X3)3个影响因素为自变量，以杀菌率(Y)为响应值，采用三因素三水平的响应面法优化分析。响应面试验设计与因素水平表见表1。

表1 响应面试验因素水平设计表Table1 Experimental factors and levels of response surface

1.3.3 ClO2溶液对猕猴桃果实贮藏品质的影响

1.3.3.1 ClO2溶液对猕猴桃果实的灭菌处理 随机选取无机械损伤、果型大小基本一致的海沃德猕猴桃果实，每100个猕猴桃作为一个样本。采用手持喷雾器将已培养106cfu·mL-1的Psa菌悬液均匀喷布于果面，使果实均匀着菌，重复3次。对照组喷施蒸馏水(CK1)。根据以上试验及响应面试验结果，选取ClO2溶液对Psa杀菌率大于95%的3组试验条件对已染菌的海沃德猕猴桃果实进行处理，即T1:ClO2溶液浓度为 120 mg·L-1、时间 6 min、pH 值 4；T2:ClO2溶液浓度为 100 mg·L-1、时间 6 min、pH 值 2；T3:ClO2溶液浓度为115 mg·L-1、时间8 min、pH值4。 喷施菌悬液的对照组(CK2)用灭菌蒸馏水进行处理。分别配置以上浓度、pH值进行相应处理，将果实完全浸泡在ClO2溶液中，处理相应时间后将果实晾干置于20℃培养箱中，每隔5 d测定一次指标，每组选取6个果实重复测定3次。

1.3.3.2 ClO2溶液对猕猴桃果实表面Psa的杀菌效果分析 分别从3组处理中随机选取6个果实，均匀切取果皮(0.5～1 mm2)于100 mL液体培养基中，24℃恒温振荡过夜培养12 h，稀释并均匀涂布于固体培养基，统计单菌落个数，重复3次。对照组方法与试验组一致。按照公式(1)计算杀菌率。

1.3.3.3 猕猴桃果实相关指标的测定 海沃德猕猴桃果实硬度、可溶性固形物含量的测定参照薛敏[26]的方法；Vc含量测定采用2，6-二氯酚靛酚法[27]；可滴定酸含量测定采用标准酸碱滴定法[28]。

采用硬度计法测定果实硬度，用刀片切除果皮组织，切除面积约1 cm2，用探头直径11 mm，测定深度10 mm的果实硬度；采用折光仪法测定果实可溶性固形物含量，用蒸馏水校零，吸取适量果汁于折光仪镜面进行测量。

1.4 数据处理

采用 SPSS 19.0进行数据分析，Microsoft Excel 2003制图。

2 结果与分析

2.1 ClO2溶液对Psa杀菌效果的影响

由图1-A可知，当 ClO2浓度为120 mg·L-1时，杀菌率可达90%以上，表明ClO2浓度越高，对Psa杀菌效果越好。由图1-B可知，处理时间为6 min时，杀菌率增加最快，处理时间大于6 min后，杀菌率增加缓慢，表明在一定时间内，处理时间越长，ClO2对Psa杀菌效果越好。由图1-C可知，pH值为2时，杀菌率最大，表明酸性条件下，ClO2对Psa的杀菌效果较好。

2.2 ClO2溶液对Psa的杀菌条件优化

根据Design-Expert 8.05b软件的设计，共设计17个试验点，12个析因试验，5个中心试验，用来估计误差，试验结果见表2。Psa的杀菌率Y与溶液浓度X1、处理时间X2、溶液pH值X3的二次多项回归方程为:

图1 ClO2溶液对Psa杀菌效果的影响Fig.1 Effect of ClO2solution on bactericidal effect of Psa

Y=84.65＋26.17X1＋17.82X2-12.15X3＋7.80X1X2-0.57X1X3-0.66X2X3-19.855X12-17.62X22-18.68X23。

由表3可知，该回归模型极显著(P＜0.01)，失拟项不显著(P=0.491 0＞0.05)，表明所建立的回归二次模型成立，可用此模型分析并预测Psa杀菌率。由回归模型系数显著性检验结果可知，ClO2浓度(P＜0.01)、处理时间(P＜0.01)、pH 值(P＜0.01)对 Psa的杀菌率影响极显著；X1X2、X12、X22、X32对Psa的杀菌率影响极显著(P＜0.01)，X2X3交互项对Psa的杀菌率影响显著(P＜0.05)，X1X3交互项对Psa的杀菌率影响不显著，表明溶液浓度和溶液pH值之间无相互协同作用。

响应曲面坡度越陡峭，表明该因素的处理效果越好，否则反之。由图2可知，各试验因子对响应值的影响的关系为X1＞X2＞X3。ClO2溶液对Psa的最大杀菌率可达到100%，此时的ClO2浓度为114.69 mg·L-1、处理时间7.87 min、pH值3.79。为了验证模型的有效性，考虑实际情况将最佳杀灭条件改为ClO2浓度115 mg·L-1、处理时间 8 min、pH 值 4，在此条件下，ClO2溶液对Psa的杀菌率为98.64%±0.18%，与预期值基本一致，说明该模型优化的条件可靠。

表2 Design-Expert试验设计与结果Table2 Design and results of Design-Expert experiments

2.3 ClO2溶液对猕猴桃果实表面Psa的灭菌效果

由图3可知，与 CK2相比，T1、T2、T3 3个处理组均能显著杀灭猕猴桃果实表面的Psa(P＜0.05)，对猕猴桃果实表面Psa的杀菌率高达95%以上，其中，T3处理组对猕猴桃果实表面Psa的杀菌率达到98.64%。

2.4 ClO2处理对猕猴桃果实贮藏品质的影响

由图4-A可知，在贮藏前期，猕猴桃果实的硬度下降迅速(从出库开始到第10天)，后期下降缓慢。贮藏第10天时，T2组果实硬度低于CK2，无显著差异；贮藏10天后，T1组果实硬度与CK2无显著差异，T2组的果实硬度小于CK2；整个贮藏期间，CK2的猕猴桃果实硬度由 9.64 kg·cm-2下降到 2.78 kg·cm-2，T3 组的硬度由 9.64 kg·cm-2下降到 3.47 kg·cm-2，与 CK2的第25天硬度相比有显著性差异(P＜0.05)。贮藏期间，喷施Psa和不喷施Psa的果实硬度基本一样，无差异性差异，说明喷施Psa对果实硬度无影响，适宜浓度的ClO2处理猕猴桃果实，能延缓果实硬度的下降。

表3 响应面试验结果方差分析Table3 Variance analysis of response surface experiment results

图3 ClO2处理对猕猴桃果实表面Psa的杀菌效果Fig.3 Effects of chlorine dioxide on Psa of kiwifruits surface

猕猴桃果实可溶性固形物含量的高低代表果实的成熟度，硬度越小，含量越高。由图4-B可知，在贮藏期间，猕猴桃果实的可溶性固形物含量逐渐上升。贮藏第5～第10天时，T1、T2、T3组的可溶性固形物含量均显著性低于CK2(P＜0.05)；在贮藏第25天时，T2、T3组的猕猴挑果实可溶性固形物含量高于CK2，而T1组的可溶性固形物含量低于CK2，且无显著差异。贮藏期间，喷施Psa和不喷施Psa的可溶性固形物含量基本一样，无差异性影响，表明喷施Psa对果实可溶性固形物的含量无影响。

由图4-C可知，贮藏期间，猕猴桃果实Vc含量趋于下降的趋势。贮藏第0～第10天时，T1、T3组的猕猴桃果实Vc含量高于CK2，c组差异显著(P＜0.05)，T1组无显著性差异，T2组Vc含量低于CK2，无显著性影响；贮藏第15天后，Vc含量下降较缓慢，在贮藏第25天时，T2组Vc含量显著低于CK2(P＜0.05)，而T1、T3组较CK2相比无显著差异。贮藏期间，喷施Psa和不喷施Psa的Vc含量基本一样，无差异性影响，表明喷施Psa对果实Vc含量无影响，适宜的ClO2溶液浓度能抑制Vc含量的降低，尤其以T3组的处理效果显著。

由图4-D可知，贮藏期间，猕猴桃果实中可滴定酸含量下降，T3组果实中可滴定酸的含量均高于其他组。在贮藏第25天，T2组的猕猴桃果实中可滴定酸的含量均低于CK2，且差异不显著，但T3组显著高于CK2(P＜0.05)。整个贮藏期间，喷施 Psa和不喷施Psa的可滴定酸含量基本一样，T3组提高了可滴定酸含量，延长了猕猴桃果实的贮藏期。

图4 ClO2处理对猕猴桃果实贮藏期品质的影响Fig.4 Effect of chlorine dioxide on quality of kiwifruits during shelf life

3 讨论

3.1 ClO2处理对Psa杀菌效果的影响

目前，对猕猴桃溃疡病的防治主要是使用抗菌素和铜制剂农药[29-30]，但长期大量使用抗菌素和铜制剂会使植物产生抗药性，同时使得果实农残超标，影响果品质量安全。ClO2作为一种绿色安全高效的杀菌剂，适合果蔬表面杀菌消毒[31-34]，且ClO2对猕猴桃表面微生物灰霉、青霉、链格孢等具有较强的杀灭作用。本研究筛选出ClO2对猕猴桃果实表面Psa最佳杀菌工艺条件为 ClO2浓度 115 mg·L-1、处理时间 8 min、pH值4，杀菌率可达到100%，表明ClO2对Psa具有高效杀灭作用，用优化的ClO2溶液杀菌条件浸泡或喷洒果实，能有效控制果实传播Psa。但由于ClO2对光比较敏感，见光易分解，因此ClO2是否可用于猕猴桃溃疡病大田防治，仍有待进一步研究。

3.2 ClO2在猕猴桃保鲜中应用的潜在价值

近年来，ClO2用于猕猴桃保鲜的研究逐渐增多，ClO2溶液采前喷洒[35]或采后入库前浸泡果实[36]对猕猴桃都具有较好的防腐保鲜效果，邓雷等[37]研究发现ClO2缓释剂对贮藏90 d出库的秦美猕猴桃具有较好的保持效果。本研究筛选出对Psa杀菌率在95%以上的3组工艺条件，处理贮藏110 d后出库的海沃德猕猴桃果实，发现T1、T3处理组均能显著减缓猕猴桃果实硬度、可溶性固形物含量的下降(P＜0.05)，维持滴定酸含量，同时减少Vc含量的下降，延长果实的货架期，与文献[35-36]研究结果一致。入库前用ClO2溶液浸泡猕猴桃果实虽具有较好的防腐保鲜效果，但浸泡的果实不易晾干，入库贮藏会增加冷库的湿度，增大霉烂的风险。本研究与文献[36]不同的是在猕猴桃出库后用ClO2溶液浸泡果实，可有效地延长货架期；浸泡后的果实不再进入冷库贮藏，而直接进入运输、销售环节，残留在果实表明的ClO2溶液在运输、销售环节逐步晾干，不会增加霉烂的风险，因此，在猕猴桃出库后用ClO2溶液浸泡果实对延长猕猴桃货架期有潜在的应用价值。

4 结论

本研究结果表明，既能杀灭猕猴桃表面Psa又能保持果实货架期品质的ClO2溶液处理的最佳工艺条件为ClO2浓度115 mg·L-1、处理时间8 min、pH 值 4，在此条件下，ClO2溶液对Psa的杀菌率为98.32%；ClO2溶液处理能延缓猕猴桃果实硬度的下降，保持果实可溶性固形物、Vc、可滴定酸的含量，延长果实的货架期并保证果实的营养价值。ClO2处理猕猴桃操作简单，成本低，适用于国内猕猴桃销售过程及国际间猕猴桃进出口过程控制果实传播Psa，也适用于猕猴桃运输销售过程保持果实品质。