高压电晕电场生物效应研究评述

宋智青 丁昌江 栾欣昱 陈 浩

(内蒙古工业大学理学院，内蒙古呼和浩特 010051)

在电场生物效应研究领域，主要涉及利用高压电场对生物体进行诱变[1]、灭杀[2-4]，进而辅助外源基因转移等[5]。随着电磁辐射与生物科学交叉领域的发展，高压电场生物效应的研究逐步从宏观生物效应向微观机制发展，如从电场对农作物或微生物产量和质量的影响向电场对细胞、大分子等的影响方向深入。近年来，高压电场微观生物效应研究主要集中于细胞和分子水平，用于研究的电场也主要是脉冲电场或匀强电场。大量研究表明，电场作用能引起生物体细胞的凋亡和坏死[6-7]、细胞膜电穿孔[8-9]、酶活性改变[10]、DNA和RNA损伤等[11-12]。非均匀电场由于其不仅有电场作用，还涉及电晕放电、等离子体注入、二次电子发射等多因素综合作用，其机制比较复杂，也较少被应用于生物效应，尤其是诱变育种的研究。截至目前，针对高压电晕电场(high voltage corona electric field，HVCEF)生物效应的研究并不常见，尤其是高压电晕电场与生物体在细胞水平或分子水平作用机理尚鲜见报道。本文综述了高压电晕电场对大肠杆菌及其他物种的生物效应，综合分析了电晕电场的生物效应机制，以期为高压电晕电场生物效应的技术应用研究提供理论依据。

1 高压电晕电场生物技术及装置

高压电晕电场是指能产生局部电晕放电的非均匀电场，在非均匀电场中，电极的尖端处电力线最集中，电场强度也最大，当加上高压后，由于空气游离会在电极附近产生局部电晕放电。电晕电场生物效应的装置基本结构详见图1。高压电源可接不同输出的电源。电极系统须有尖端，一般为单针-板极、多针-板极、多针-网极、线-板极等。以多针-板极电极系统为例，高压电极为针，针间距可调，接地极一般为平面铝板，极距一般连续可调。

图1 高压电晕电场诱变装置Fig.1 Mutagenesis device of high voltage corona electric field

根据静电学理论可知，带电导体所携带的电荷集中在导体的表面，面电荷密度与导体的曲率半径密切相关，针尖表面的面电荷密度远高于其他部位，因此其附近的电场强度也较强。图1加高压的电极为针状阵列电极，电位升高到一定程度时，针尖处积累的大量电荷所产生的强电场使针尖周围的空气电离，从而产生局部放电，出现晕光。高压电晕电场诱变装置中采用多针阵列电极，与单针电极相比，多针阵列电极起晕电压较低，且这种电极间的相互作用可使空间电场分布更均匀，可以在更宽的电压范围内保持稳定的电晕放电，更适用于生物效应和诱变机制研究[13]。

目前，多针-板电极结构的高压电晕电场已被广泛应用于生物物料干燥及静电除尘[14-17]。高压电晕电场生物技术是非均匀电场、电晕放电、等离子体注入、二次电子发射等多种物理因素协同作用产生的，其作用机制与高压均匀电场(high voltage electrostatic field，HVEF)不同，且具有装置简单、生物效应明显、环境友好等优点，已被国家专利局正式授为实用新型专利[18]。近年来，高压电晕电场生物技术已被广泛应运于生物诱变、转基因及灭菌等方面[1，2，19-22]。

2 高压电晕电场生物效应研究进展

2.1 高压电晕电场对大肠杆菌诱变研究

近年来，内蒙古工业大学电磁场技术及应用课题组以野生型大肠杆菌K12W3110为研究对象，基于lac操纵子表达调控原理，运用多针-板电晕电场、平板均匀电场、平板变频电场对野生大肠杆菌K12W3110进行诱变研究，筛选得到lacI基因突变的大肠杆菌菌株[19-20，23]，与低能等离子体诱变[24]相同菌株的结果进行比较，发现4种物理诱变技术在最佳诱变参数条件下，高压电晕电场的诱变率最高，是对照组的12.48倍，且存活率也较高，证明高压电晕电场诱变具有损伤低和突变率高的特点。根据静电学知识可知，在平板均匀电场中，由于外电离因素影响而产生带电粒子，当电压升高时，带电粒子的数量和速度随之增加，进而发生电子碰撞电离，造成辉光放电，电压继续升高时会造成空气击穿，因此均匀电场不产生电晕放电，说明高压均匀电场不会电晕放电，其对大肠杆菌有一定诱变效应，但作用效果不强[25]。高压电晕电场可产生电晕放电，激发等离子体。宿鹏浩等[26]对电晕放电电离区形貌研究发现，在常压空气中，放电中受激物质主要是N2，单一等离子体N＋在损伤较大的情况下，对大肠杆菌的诱变率低于高压电晕电场，但等离子体诱变效果优于均匀电场(表1)。

表1 不同物理诱变技术对大肠杆菌W3110的诱变效果比较[19-20，23-24]Table1 Comparison of the mutagenic effects of different physical mutation technologies on E.coli.W3110[19-20，23-24]

由表2可知，高压电晕电场诱变几乎包含了lacI基因的所有突变类型，包括突变热点±TGGC、碱基置换、单碱基插入缺失、多碱基插入缺失，特别是包含280 bp缺失的大片段结构变异，说明高压电晕电场诱变具有突变谱广的特点。CK的主要类型在lacI突变热点±TGGC处，占所有突变类型的69%；高压电晕电场组的突变类型则更为广泛，±TGGC处的突变仅占所有突变类型的26%；AT到TA的颠换提高至21%。从碱基对的变化来看，高压均匀电场和高压变频电场突变结果类似，而与高压电晕电场差异较大，说明高压电晕电场诱变机制具有独特性，诱变效应是协同作用的结果。

表2 不同诱变技术引起的lacI基因突变谱[19-20，23-24]Table2 Spectra of lacI gene mutants induced by different mutation technologies[19-20，23-24]

2.2 高压电晕电场对其他物种生物效应的研究

杨晓桐等[1]利用单针-板高压电晕电场2次连续诱变出芽短梗霉菌，突变株多糖产量高达9.57 g·L-1，约为原始菌株的3倍，发酵液颜色为米白色，连续传代培养10代，突变株性状和产量无明显变化，传代稳定；宋智青等[18，21]利用高压电晕电场对黄霉素产生菌和纳豆芽孢杆菌进行诱变，发现诱变后均筛选出高效高产的突变菌株。Wang等[27]采用多针-板电晕电场处理棉花种子，种子表面的傅里叶红外光谱检测表明，电晕放电形成的等离子体活性物质对种子表面有化学和物理刻蚀作用，使种子表面脊状突起变薄，并产生2 μm级的刻蚀裂纹，这种化学和物理刻蚀在种子萌发理化反应过程中起着非常重要的作用，有利于棉花种子的萌发，表明高压电晕电场是一种环保的、有效的诱变方式；Schmiedchen等[28]认为小于35 kV·m-1的静电场可引起无脊椎动物的行为反应，且对无脊椎动物和植物的生物学功能未产生不良反应，当场强水平大于35 kV·m-1时，会引起无脊椎动物和植物生理学和形态学上的不良反应，而这些反应是由于电晕放电作用引起的；Mikhaylin等[29]利用单针-板电晕电场处理β-乳球蛋白发现，高压电晕电场能诱导蛋白质分子的活性位点形成亲核酶作用，从而释放生物活性肽和功能活性肽，使β-乳球蛋白水解率提高66%；袁丽丽等[30]利用单针-板高压电晕电场诱变北虫草分生孢子，获得了与原始菌株拮抗线明显的突变菌株，突变株经简单重复序列区间(inter-simple sequence repeat，ISSR)分析，发现两者电泳图谱有明显的差异，说明突变株在DNA水平上发生了变异，具有遗传多样性，且中性突变率较高；那日等[31]采用高压电晕电场处理细枝岩黄芪种子，并以该种子为外植体诱导愈伤组织，发现电晕电场处理可提高愈伤组织诱导率和分化率，促进愈伤组织的形成。综上，高压电晕电场作用于生物或大分子，既有电晕放电产生等离子体的直接刻蚀作用，又有等离子体活性成分的间接作用和非均匀电场的作用。

3 高压电晕电场生物效应机制

3.1 高压非均匀电场的电穿孔作用

细胞膜自身为介电材料，当细胞膜在正常环境状态下，其自身维持较低的电位差，但当细胞处于高压电场环境时，细胞膜的电位差会发生改变，出现跨膜电位，当跨膜电位超过临界值，就会使细胞膜崩解；当外加高压电场后，细胞膜各点受到电场力的作用，细胞膜上的分子或离子会发生碰撞、吸引、排斥等一系列运动，导致细胞膜上出现孔洞，细胞电穿孔使膜内分子间相互作用力的平衡遭到破坏[8]。白爱枝等[23]研究结果表明，经高压电场处理后，大肠杆菌的形态发生了明显变化，细胞膜和细胞壁损伤严重，细胞内容物溢出，这是高压非均匀电场对细胞的电穿孔作用[18-19，32]。

3.2 离子风的直接刻蚀和注入作用

电晕放电可以使空气电离产生较多低温等离子体，这些等离子体由 OH、H2O2、O、N＋、N2＋、O-2等自由基、活性原子和正负离子组成，并在电场作用下形成离子风。Zhang等[33]研究针-板电晕场对水的作用发现，离子风速度可以达到7 m·s-1，对其下面的水面冲击较大，侧面说明低温等离子体对其下面的物质与细胞冲击相当，等离子体注入细胞诱变效应显著。由于注入的各种离子和胞内分子发生了质量沉积、能量交换和电荷转移等反应，离子注入会造成生物材料的严重刻蚀损伤[27]。此外，沉积的离子与细胞内的生物分子或原子的替换、重组和复合，以及电荷转移，改变了细胞的电位分布，加速了DNA突变，产生遗传多样性[34-36]，进一步加强了高压电晕电场的诱变效应。而平板均匀电场由于不发生电晕放电，没有等离子体刻蚀注入作用，因此诱变效应不明显。

3.3 等离子体活性物质与生物体的作用

Rybenkov等[37]发现常压等离子体处理后的细胞，其细胞膜通透性增强，且该变化是非致死可恢复的。有研究者利用常压低温等离子体诱变处理了鼠伤寒沙门氏菌、大肠杆菌、链霉菌、放线菌等微生物，结果表明其可以使微生物一些蛋白质酶活性发生改变、DNA损伤等一系列生理生化和细胞分子水平的变化，进而造成微生物突变，且常压低温等离子体诱变技术是一种高效环保的诱变技术[38-39]。由于高压电晕电场和生物体是在开放的大气环境下进行作用的，因此，常压低温等离子体与生物体作用是非常重要的因素。空气或者样品基质中的氧气被离解和激发，会产生各种活性氧成分(reactive oxygen species，ROS)。ROS是电磁因果链原初作用中连接物理和生物解释的一个重要标志物，等离子体作用后，在细胞基质中产生的ROS进入细胞，从而与细胞中的大分子发生作用，如与蛋白质作用形成超氧化物，或与DNA作用发生DNA的烷基化或链间交联，从而改变细胞的代谢活性和遗传特性，其为等离子体在不造成细胞破裂和致死的条件下，造成细胞内遗传和代谢变化的主要作用方式之一[40-43]。

3.4 等离子体注入与二次电子发射对生物体的影响

研究表明，等离子对生物体是一种表面的作用[44]，等离子体产生的活性粒子在生物物质中的渗透深度缺乏定量的阐释[45]。黄旭初等[46]研究表明，200 keV的Ⅴ＋注入花生种子的最大射程是可达800 μm，而高压电晕电场生物技术装置产生的等离子体的能量也可达keV量级以上，表明等离子体完全可以作用于生物体内部。此外，等离子体作用生物体后即使射程并不深，但由于信号的传导，可以引起长程旁效应，即在个体水平上存在辐射的长程旁效应，进而引起损伤突变[47]。大量研究表明，高能离子对生物体的辐射损伤实际上是一系列低能事件的综合结果[48-49]。keV能量级等离子体注入生物体后，首先与生物分子相互作用，形成二次电子，二次电子发射后可造成DNA分子链断裂或碱基损伤[50]。Song等[51]研究也证明等离子体注入后的二次电子发射是引起大肠杆菌突变的重要原因之一。

4 高压电晕电场生物技术的优势及不足

4.1 优势

与其他大部分物理诱变技术相比，高压电晕电场处理装置十分简单，只需高压电源和电极系统，且可根据实验需要随时搬运，占地面积小。若处理某些样品需要无菌条件时，只需将电极系统放入超净工作台即可。此外，该装置是在常温常压下进行，也可根据处理需要，将电极系统放入储气腔体来改变工作气压和气体种类；实验过程对样品基本没有要求，且不需要专人操作，购置成本低[18]。

高压电晕电场生物效应明显，特别是诱变效应，该技术具有高存活率、低损伤、高突变率，产生的突变谱广，处理后代中中性突变较多，有利于筛选优良种质等优势[19，30]。近年来由于单一诱变因子的疲劳效应，研究学者逐步尝试多种物理因子的复合诱变，这种复合诱变产生了明显的生物效应和较好的诱变效果[52-53]。而高压电晕电场的诱变也是多因子复合作用的结果。

高压电晕电场基于非均匀电晕放电，属于非电离辐射诱变技术，实验过程无需防护，实验装置能耗低，不排放有害气体和废弃物。实验过程中产生的等离子体活性物质(如O3)具有强氧化性且氧化产物对环境无污染性，被广泛用于污水、引用水处理、食品保鲜、医学消毒、特别是空气净化和废气处理等领域，对环境保护非常有益[54-55]。

4.2 不足

高压电晕电场属于非均匀电场，在处理生物体时，会造成单一生物个体接收到的剂量不均匀。实验过程中由于针和针之间有一定距离，诱变个体因接收剂量不同，诱变效果有一定差异。处在针极正下方的生物体，诱变效应会更加明显，离高压针极相对较远的生物体诱变效应较差。高压电晕电场生物效应是由多因子复合作用形成的，而复合诱变的作用机制研不是单因素的简单叠加，造成该技术作用机制的研究较为困难。

5 展望

目前高压电晕电场生物效应的研究仍处于材料基础阶段，尚需大量的基础材料积累，以对高压电晕电场生物技术体系中复杂的生物物理化学过程进行更深入、细致的研究:建立数学模型，形成全面的高压电晕电场生物技术理论体系，为高压电晕电场在诱变育种及其他领域如生物医学、干燥、材料科学、能源环境以及国防安全等更广泛应用提供实践指导。下一步可以从以下几个方面进行更深入的研究。对电晕放电所产生等离子体的物理特性进行诊断，以确定电晕放电对生物效应的贡献率；建立变异株的高通量的筛选体系，

对稳定突变株进行全基因组重测序，研究高压电晕电场生物技术的损伤修复机制，从表型到基因层面探讨高压电晕电场生物技术诱变特点和分子机制；检测生物体内ROS水平、自由基含量及DNA链断裂情况，为高压电晕电场生物技术作用机制研究奠定基础；利用高压电晕电场对生物大分子进行体外处理，并检测诱变后生物大分子结构和功能的变化。