韭菜迟眼蕈蚊在川芎上的为害及鉴定

杜立新，宋 健，贾海民，曹伟平，李耀发，张 晓

(1.河北省农林科学院 植物保护研究所，河北省农业有害生物综合防治工程技术研究中心，农业部华北北部作物有害生物综合治理重点实验室，河北 保定 071000;2.河北省农林科学院，河北 石家庄 050031)

川芎(LigusticumchuanxiongHort)，属伞形科藁本属，多年生草本植物，其干燥根茎是我国传统中药[1]。川芎主产自云贵川地区，我国华北地区也有栽培[2]。川芎是有活血、散风、止痛的功效，与其他药物搭配可治疗冠心病、心绞痛等病症[3-5]。近年来，川芎的经济价值客观，成为农业增收的主要栽培作物之一。随着种植面积的扩大，川芎病虫害发生日趋严重，严重影响到川芎的产量、品质及农民的经济收入。研究表明，生产上为害川芎的主要害虫有茎节蛾、斜纹夜蛾、蛴螬、红蜘蛛和种蝇等[6]，还未见有韭菜迟眼蕈蚊(Bradysiaodoriphaga)为害川芎的相关报道。

韭菜迟眼蕈蚊，属双翅目、眼蕈蚊科、迟眼蕈蚊属，在我国广泛分布，是我国的特有害虫[7]。该虫主要为害百合科、藜科、菊科、十字花科、葫芦科和伞形科等6科30多种蔬菜[8-9]。韭菜迟眼蕈蚊主要靠幼虫群居在蔬菜根茎部位进行啃食为害，造成植株枯萎、甚至死亡，严重影响蔬菜的产量和品质。

2017年9月河北省安国市川芎种植户反映当地中药材川芎出现大量黄叶、死苗现象，根茎部严重受害，河北省农林科学院植物保护研究所组织相关人员初步鉴定为根蛆为害。本研究对安国市川芎根蛆的为害情况进行了调查，并通过成虫形态鉴定结合DNA条形码技术对川芎根蛆种类进行了鉴定，旨在为川芎根蛆的绿色防控提供理论科学依据。

1 材料和方法

1.1 川芎根蛆为害情况

2017年9月10日在河北省安国市对川芎根蛆发生为危害情况进行调查。在地块内调查采取“Z”型5点取样，每点连续调查10株川芎，记录川芎被害株数、死株数和每株川芎块茎根蛆幼虫虫口数量，计算虫株率、死苗率和单株虫口数量。

1.2 供试昆虫

川芎根蛆：于2017年9月10日采自河北省安国市霍庄村。采集的根蛆幼虫1/2直接用于分子生物学鉴定试验，1/2继代饲养至成虫用于形态特征鉴定。羽化成虫后，将成虫标本与韭菜迟眼蕈蚊成虫形态进行比对，进行初步的形态鉴定。

韭菜迟眼蕈蚊：河北省农林科学院植物保护研究所微生物杀虫剂课题组室内饲养种群，采用韭菜鳞茎在90 mm培养皿中，于人工气候室中(宁波东南仪器厂)连续饲养多代，温度(25±1)℃、光周期16L∶8D、相对湿度70%。

1.3 川芎根蛆分子鉴定

1.3.1 总DNA提取 参考TaKaRa MiniBEST Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.5.0试剂盒说明书方法分别对川芎根蛆和韭菜迟眼蕈蚊幼虫DNA进行提取，每个调查点随机选取3头川芎根蛆幼虫，共计90头；选取韭菜迟眼蕈蚊幼虫3头作为对照。所得的DNA于-20 ℃保存。

1.3.2 PCR反应条件 所用引物为通用引物LCO1490(5′-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3′)和HCO2198(5′-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAAT CA-3′)，扩增产物大小为710 bp左右。PCR扩增条件参考文献[10]。

1.3.3 琼脂糖凝胶电泳 PCR产物进行1.0%琼脂糖凝胶电泳，GoldViewⅠ染色后在紫外透视仪上观察，记录结果。

1.3.4 序列鉴定 将PCR产物送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行双向测序。每个样品 3个重复。将所测得的川芎根蛆的mtDNA-COI序列在GenBank中进行同源性比较。

2 结果与分析

2.1 川芎根蛆为害情况

川芎根蛆为害率为4%～82%，死苗率可达22%，单株平均虫口数量可达37.76头，不同地块间存在显著差异(表1)。川芎根蛆主要以幼虫钻驻川芎根茎部为害，导致地上叶片萎蔫；严重时将根茎挖空，造成整株川芎死亡(图1)；川芎根蛆点片发生分布不均匀。

2.2 川芎根蛆形态鉴定

经川芎根蛆成虫与韭菜迟眼蕈蚊成虫形态特征比对，初步明确该虫为双翅目(Diptera)眼蕈蚊科(Mycetophilidae)迟眼蕈蚊属(Bradysiawinnertz)韭菜迟眼蕈蚊(Bradysiaodoriphaga)，韭菜迟眼蕈蚊属全变态昆虫，在个体发育中，经过卵、幼虫、蛹和成虫等4个时期，卵，椭圆形，孵化前变乳白色，呈堆状，当卵壳上出现小黑点时即将孵化；幼虫，体细长，头漆黑色有光泽，初半透明状后呈乳白色，共4龄，老熟幼虫体长5.5～7.0 mm。蛹，裸蛹，体长2.7～4.0 mm，长椭圆形，初期黄白色，后转黄褐色，羽化前成灰黑色。成虫，体细长，黑褐色，形似蚊子。雄成虫体长3.0～5.0 mm，头小，复眼发达；触角丝状，16节，其梗节粗大呈球形；胸部发达，背面隆起；足细长，前足胫节端部具胫梳5根和1根距，中、后足各2根距；前翅长2.2～2.9 mm，宽1.0～1.2 mm，具有淡紫色金属闪光，翅脉褐色，后翅退化为平衡棒。腹部背面1～8节各有一块长方形的黑斑，节间膜乳白色，外生殖器宽大，其端节向内弯，使抱器形成钳状，顶叶端具6～7根粗刺。雌成虫体长4～5 mm，与雄虫基本相似，但触角短且细，腹部中段粗大，向端部渐细而尖，腹端具1对分为2节的尾须[11-12]。

表1 川芎根蛆为害情况调查结果Tab.1 Survey on damage to Chuanxiong by root maggot

注：表中数据为平均值±标准误，同列数据后不同字母表示经Duncan′s 新复极差法检测在 5%水平上差异著。

Note: Data were mean±SE, data in a column with the different lowercase letters are significantly different at 0.05 level using Duncan′s range test.

图1 川芎根蛆为害川芎植株及根茎症状Fig.1 The harm symptoms of Chuanxiong plants and rhizome symptoms by root maggots

M. DL2000 Marker；1-5. 川芎根蛆5个样品。M. DL2000 Marker;1-5. Five samples of Chuanxiong root maggot.

2.3 川芎根蛆分子鉴定

由图2可知，PCR产物片段大小均在709 bp左右(图2)，与预期产物大小相近，可以初步判定该产物是所需的目的片段。测序结果显示，所有样品序列均约710 bp，序列相似性为99%；将川芎根蛆(Root maggot)mtDNA-COI序列(图3)在NCBI中进行同源性比较，发现与韭菜迟眼蕈蚊 isolate ShenweimtCOI序列相似性为99%。

2.4 川芎根蛆系统发育分析

利用MEGA 6.0 软件构建川芎根蛆的系统发育树，结果表明，川芎根蛆与韭菜迟眼蕈蚊B.odoriphagaisolate Shenwei聚合在一起(图4)，再与韭菜迟眼蕈蚊B.odoriphagaisolate Huaishang、B.odoriphagaisolate Lumiao、B.odoriphagaisolate Duji、B.odoriphagaisolate Nidian和B.odoriphagaisolate Yanji聚在一起，而与尖眼蕈蚊科KP038529.1 Sciaridae sp. BOLD:AAH3919 voucher BIOUG04652-B01COIgene、KP044556.1 Sciaridae sp. BOLD:ACE0776 voucher BIOUG04645-C12COIgene和KP046352.1 Sciaridae sp. BOLD:AAH3919 voucher BIOUG04652-H05COIgene相距较远，说明川芎根蛆属于韭菜迟眼蕈蚊。

图3 川芎根蛆与韭菜迟眼蕈蚊 isolate Shenwei mtDNA-COI序列比对Fig.3 mtDNA-COI gene sequence comparison between B. odoriphaga isolate Shenwei and Chuanxiong root maggot

图4 基于川芎田韭菜迟眼蕈蚊mtDNA-COI基因构建系统发育树Fig.4 Phylogenetic tree of mtDNA-COI gene in Bradysia odoriphaga from Chuanxiong

3 讨论

韭菜迟眼蕈蚊在我国分布广泛，东至东北辽宁、西至甘肃、北至内蒙古、南至台湾等18个省(自治区、直辖市)均有分布，其中以河北、山东、天津、黑龙江等北方各省受害严重[13]。此外，韭菜迟眼蕈蚊寄主种类繁多，其中以韭菜、圆葱、大蒜、莴苣为主，近年来，韭菜迟眼蕈蚊在菊科生菜上为害也非常严重[14-15]。目前报道为害中药材的根蛆种类主要以种蝇为主，本研究根据川芎根蛆成虫形态特征与韭菜迟眼蕈蚊成虫形态特征进行比对，初步明确为害安国川芎田的根蛆种类为韭菜迟眼蕈蚊，后经分子鉴定技术对川芎根蛆mtDNA-COI基因序列与韭菜迟眼蕈蚊mtDNA-COI序列比较，相似度达到99%，进一步明确河北安国地区对川芎造成为害的根蛆为韭菜迟眼蕈蚊。韭菜迟眼蕈蚊在不同地区、不同作物、不同栽培模式和不同年份的发生规律均存在一定的差异。因此，韭菜迟眼蕈蚊在川芎上的发生规律还需要进一步研究。

在双翅目眼蕈蚊科中，因迟眼蕈蚊属包含种类多且含有部分模糊的复合种，因此对其种类鉴定较困难，在形态学上存在很大争议。目前对迟眼蕈蚊属种类的鉴定是基于雄成虫形态特征[16-17]。DNA技术(Barcoding)是利用基因组DNA上一段标准的或大家公认的基因片段作为分子靶标进行种级水平的种类鉴定[18]。Shin等[19]研究发现，利用DNA分子鉴定技术可对迟眼蕈蚊属幼虫种类进行准确鉴定。细胞色素氧化酶Ⅰ(Cyto-chrome oxidase I，COI)，由于其相对容易扩增，且其在种内变异速率较小，在种间变异速率较大，已成为DNA条形码在动物界的主要分子标记，被广泛用于近缘物种间的系统进化研究[20]。本研究采取成虫形态学和mtDNA-COI分子标记2 种鉴定方法对川芎根蛆的种类进行了鉴定，共同明确了川芎根蛆即为韭菜迟眼蕈蚊，鉴定结果更加真实可靠。

本研究主要明确了造成安国川芎根茎部严重为害的根蛆种类及为害情况，为指导安国川芎根蛆的防控提供了目标和方向。同时考虑到川芎主要以干燥的根茎入药，在防治川芎根蛆时，建议主要采用绿色安全的防治措施[21]，重点采用轮作、物理诱杀[22]、生物源农药[23]等防治措施，必要时采用低毒、低残留的化学药剂进行防治[24]。