胎盘组织中CYP1A1表达在孕期香烟烟雾暴露致胎鼠宫内发育迟缓中的作用

蔡恒 李智文 滕佩宏 贾童童 王越 张永镇 于向民 王东

胎儿宫内发育迟缓(intrauterine growth retardation, IUGR)是围产儿死亡和出生后生长发育落后等的重要原因，已受到国内外学者的广泛关注[1-3]。研究表明[4-5]，妊娠期间香烟烟雾暴露是导致IUGR的常见原因之一。香烟烟雾中的有害化合物众多，不仅对母体产生伤害，而且影响胚胎的发育过程。胎盘是胎儿从母体获得生长发育所必需的营养物质、排除自身代谢废物的重要器官，同时它又对可能进入胎儿体内的有害物质起到重要的屏障作用。在胎盘中存在多种微粒体细胞色素P450(cytochrome P450， CYP)酶系，有研究指出CYP1A1、CYP1B1和CYP2B1等主要参与致癌物的氧化代谢，并在芳香化合物、尼古丁等的代谢中发挥重要作用[6]。然而，香烟烟雾暴露时胎盘中CYP同工酶的变化情况与IUGR发生之间的关系研究较少。鉴于此，本研究在建立金黄地鼠被动吸烟模型的基础上，观察IUGR的发生率与CYP1A1表达变化的关系，从而为探讨被动吸烟导致IUGR的机理提供实验依据。

材料与方法

一、材料

1.实验动物：未经产的SPF级雌性金黄地鼠60只和雄性20只，体重(100±10) g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司(SCXK(京)2012-0001)。

2.实验动物分组：80只金黄地鼠适应性饲养1周，常规饮水，于每晚8：00～9：00将雌鼠和雄鼠1：1合笼，每晚大约合笼5对，次日早8:00阴道涂片，检查到精子者定为受精后的第1天(E 1d)。将孕鼠随机分为被动吸烟组和对照组，每组30只。

二、方法

1.香烟烟雾暴露处理：被动吸烟组所有孕鼠从受精后的第1天开始在自制被动吸烟箱(60 cm×60 cm×100 cm)中进行香烟烟雾暴露，使用上海烟草集团有限责任公司生产的X牌香烟(焦油量：8 mg；烟气烟碱量：0.6 mg；烟气一氧化碳量：9 mg)进行烟熏，每天2次，每次10支香烟，每次熏烟持续时间15分钟。对照组除箱内无烟熏外，其余条件与被动吸烟组同。

2.动物标本获取：被动吸烟组和对照组的所有孕鼠于受精后的第11天(E 11d)麻醉后，剖腹，取出子宫，在体视显微镜下剖开子宫，取出胚胎和胎盘。观察胚胎的发育情况，记录胚胎数及吸收胚胎数，测量胎盘重量、活胎的体重和体长。IUGR判断标准：将低于对照组活胎平均体重2个标准差诊断为IUGR[7]。

3. 免疫组织化学染色：分别从每窝的胚胎和胎盘中随机取5只胚胎和胎盘，进行常规固定、石蜡包埋和切片(厚度4 μm)，石蜡切片脱蜡后，经双氧水甲醇封闭内源性过氧化物酶，滴加山羊血清封闭液，之后分别滴加CYP1A1、Bcl2和BAX抗体，4℃孵育过夜，复温后滴加抗兔辣根过氧化物酶标记聚合物，DAB显色，苏木精复染后常规脱水、透明、封片。光镜下观察、拍照。在染色过程中，设阴性对照(用PBS代替一抗，其余步骤同上)，以排除假阳性结果。利用Image Pro Plus 6.0(IPP)图像分软件测量所有免疫组织化学染色标本的平均光密度值(Optical Density，OD)，同一只金黄地鼠的胎盘组织切片的染色结果求均值，以表示其蛋白的表达量。

结 果

一、被动吸烟导致胎鼠宫内发育迟缓:被动吸烟组孕11天的每胎仔数为(15±4)，对照组为(12±4)，两组相比较有统计学意义。胚胎的体重为(81.6±2.3)mg，低于对照组胚胎体重(105.5±0.7)mg，两组的差别有统计学意义。相对应的被动吸烟组胚胎的体长(7.2±0.4 mm)低于对照组(7.8±0.3 mm)，两组的差别有统计学意义(表1)。被动吸烟组IUGR的发生率为27.4%(20/73)，明显高于对照组的2.3%(2/88)，差异有统计学意义(表2)。

表1 被动吸烟对胚胎体重、体长及胎盘重量的影响

Note:Compared with control group，*P<0.001

表2被动吸烟致胚胎宫内发育迟缓情况

Table2Embryonic intrauterine growth retardation caused by passive smoking

GroupsNumber ofembryosNumber ofIUGR embryosIncidence ofIUGR(%)Control group8822.3Smoking group732027.4*

Note:Compared with control group，*P<0.001

二、被动吸烟对胎盘中CYP1A1表达量的影响:被动吸烟组胎盘组织中的CYP1A1的表达量高于对照组(P<0.001)(图1)。

三、被动吸烟对胎盘中凋亡相关蛋白表达量的影响：被动吸烟组胎盘组织中抑制凋亡蛋白Bcl2的表达量低于对照组(P<0.001)，促凋亡蛋白BAX表达量高于对照组(P<0.001)(图2)，提示香烟烟雾可以促进胎盘细胞凋亡。

图1 香烟烟雾影响胎盘组织中CYP1A1蛋白的表达Figure 1 Effect of cigarette smoking on CYP1A1 protein expression in the placenta of the golden hamsters between the smoking group and control group.A. CYP1A1 expression in the control group was significantly lower than that of the smoking group after immunohistochemical staining, bar:200 μm. B. Detection of CYP1A1 expression in the placenta of two groups by using IPP image analysis software. OD value was used to indicate the level of protein expression, ***P<0.001.

讨 论

2010年我国15岁以上妇女的被动吸烟率高达71.6%，农村高于城市[8]，由被动吸烟引起的胚胎毒性作用备受关注。本研究利用金黄地鼠制备被动吸烟模型，观察香烟烟雾暴露对胚胎发育的影响。金黄地鼠的繁殖力强，每胎产仔数为4～17只，正常情况下，胎鼠在宫内的发育可有不均衡现象。本研究结果显示香烟烟雾暴露组孕11天的每胎仔数低于对照组，胚胎体重明显低于对照组，胚胎体长也短于对照组，且被动吸烟组IUGR的发生率明显高于对照组，表明香烟烟雾对胎鼠在宫内发育有显著的毒性作用。香烟燃烧可使烟雾中产生大量的活性氧自由基，此外烟雾中多环芳烃、杂环化合物、醌类等进入机体后在许多代谢酶参与下产生更大量的超氧阴离子。这些毒性物质被母体吸收后，或通过损伤胎盘的正常结构影响胚胎发育，或透过胎盘屏障直接影响胚胎的发育过程。

胎盘是胚胎从母体获得营养来源的器官，胎盘的结构和功能状态会直接影响胚胎的发育。本研究观察到被动吸烟可降低胎盘的重量，提示被动吸烟影响胎盘的发育。细胞色素P450(CYP)是一系列体内代谢的重要的Ⅰ相代谢酶，其中CYP1A1广泛分布于肺、脑和胎盘等肝外组织中[6]，在生理状态下，它在胎盘中的表达较低[9-10]，CYP1A1的底物以多环芳烃类等环境致癌物为主[11]。外源性芳香烃类化合物可通过芳烃受体激活CYP1A1基因的转录和翻译，并增强酶的活性[11]。本研究结果显示，被动吸烟组胎盘组织中的CYP1A1的表达量高于对照组，提示香烟烟雾的暴露可诱导CYP1A1蛋白表达，增加香烟烟雾的毒性作用，影响胎盘的发育，导致胎盘的重量降低。

在胎盘的发育过程中，胎盘组织的细胞凋亡和细胞增殖处于一个动态平衡状态，这一动态平衡的存在有利于妊娠状态的维持[12-13]。有研究表明，Bcl2和BAX的表达异常与胎盘细胞凋亡的发生具有一致性，提示凋亡因子可通过降低绒毛膜和蜕膜组织中Bcl2的表达、增高BAX的表达，诱导细胞凋亡，进而影响胎盘的发育，引起胚胎发育异常[14]。本研究结果显示，被动吸烟组胎盘组织中抑制凋亡蛋白Bcl2的表达量低于对照组，促凋亡蛋白BAX的表达量高于对照组，提示香烟烟雾可以促进胎盘细胞凋亡，使胎盘的重量减轻，影响胚胎发育，导致胎鼠宫内发育迟缓。