布鲁氏杆菌病检测技术研究进展

杜清春，王 鹏

（1. 大理大学公共卫生学院，大理671000；2. 云南省地方病防治所 云南省自然疫源性疾病防控技术重点实验室，大理 671000）

布鲁氏杆菌病（brucellosis），简称布病，是由革兰阴性、兼性细胞内寄生的布鲁氏杆菌（Brucella）引起的人兽共患疾病，是我国法定乙类传染病，布鲁氏杆菌由英国军医Bruce于1887年在因患马耳他热而致死的英国士兵脾脏中首次分离[1]。目前，FAO和WHO根据布鲁氏杆菌的生化特性、对自然宿主的选择性和致病性，将布鲁氏杆菌属分为6个种（species）19个生物型（biovars）。6个种分别为羊种（Brucella melitensis）、牛种（Brucella abortus）、猪种（Brucellasuis）、沙林鼠种（Brucella neotomae）、犬种（Brucella canis）和绵羊附睾种（Brucella ovis）；根据表型羊种分为3个生物型（1、2、3型），牛种分为8个生物型（1～7、9型），猪种分为5个生物型（1～5型），沙林鼠种、犬种和绵羊附睾种各一个生物型。另外还发现海洋哺乳动物有鲸型海洋种（Brucellaceti）和鳍型海洋种（Brucella pinnipedialis）2个新种，尚未正式命名和分类[1-2]。

1 布鲁氏杆菌病的危害

布鲁氏杆菌病的传染源主要是病畜和感染者（包括野生动物），其中最危险和最常见的是被感染的母畜，其流产物及产后阴道分泌物中含有大量的布鲁氏杆菌，若在处理时没有采取必要的防护措施，则极易发生感染；此外，人通过食用含病原菌的病畜肌肉、内脏和乳汁也可感染[3]。

在已知的6个布鲁氏杆菌种中，对人具有感染性和侵袭力的是羊种、猪种、牛种和犬种，其中羊种布鲁氏杆菌感染的数量最多，占90%以上[2-3]。母畜感染布鲁氏杆菌的主要临床症状是流产，其次是早产、死胎或弱胎[4]；有些母畜会发生子宫炎或脓肿导致生育能力下降、产乳量下降，有的还会发生关节炎和滑囊炎而导致跛行。公畜患病后主要表现为睾丸炎和副睾炎，后肢麻痹导致运动障碍[1-4]。

人感染布鲁氏杆菌患病后主要表现为反复持续的发热症状和关节肿胀疼痛，因关节炎而导致运动障碍。男性患者还会出现睾丸炎和前列腺炎，女性患者特别是妊娠期的孕妇会出现流产症状[5]。目前，在全球170多个国家和地区已发现人、畜布鲁氏杆菌病的存在和流行[2]。布鲁氏杆菌病的爆发流行往往会给一个国家和地区的人民带来生命和财产的巨大损失。特别是在牧区，如我国的新疆维吾尔族自治区、内蒙自治区等地，有效地防治布鲁氏菌病将直接关系到牧区人民的生活水平和我国的卫生发展，而布鲁氏杆菌病的检测是布鲁氏杆菌病防控中的重要环节，在布鲁氏杆菌病的防控中有着重要的意义。

2 布鲁氏杆菌检测技术的研究现状

2.1 病原学的检测 检测到布鲁氏杆菌是诊断布鲁氏杆菌病的“金标准”。布鲁氏杆菌对营养的需求较高，一般用血清葡萄糖琼脂培养基、胰蛋白胨大豆琼脂培养基、血液琼脂培养基、肝汤琼脂培养基等固体培养基进行培养[6-7]，待菌落长出后，根据其形态特征、生长特性、生化反应特点及染色特征进行鉴别。布鲁氏杆菌菌落生长形态呈稍隆起的圆形、边缘整齐、光滑湿润、大小为0.5～1.0 mm，在血琼脂培养基上生长为白色，且不溶血，在马铃薯琼脂培养基斜面上可长出水溶性微棕色菌苔。布鲁氏杆菌的染色一般用柯兹罗夫斯基染色法染色，在显微镜下观察，布鲁氏杆菌为红色球杆状小杆菌，而其他菌为蓝色，多呈散在分布，偶见成对、短链状或串状排列，边缘稍圆或直[8]；布鲁氏杆菌宽0.3～0.6 μm，长0.6～1.5 μm，无芽胞、无鞭毛、不形成荚膜。但是，由于布鲁氏杆菌的培养时间较长（短则3～8 d，长则可达45 d），且布鲁氏杆菌的分离率较低，常常影响临床医师对该病及时做出诊断，导致病情加重[7]；此外，布鲁氏杆菌的分离培养对实验人员和实验环境有一定的要求，需要经过生物安全培训和有经验的专业技术人员在BSL-2（Biosafety Level 2 Laboratory）级以上的实验室操作[8]。所以，布鲁氏杆菌的分离培养一般不适合临床的快速诊断和现场疫情的筛查，但可用于流行病学的追踪调查。

2.2 血清学的检测

2.2.1 虎红平板凝集实验（rose-bengal plate agglutination test，RBT） 用经培养并灭活的布鲁氏杆菌作为抗原，离心收集菌体经虎红染料染色后悬于乳酸缓冲液中制成。因该方法灵敏度高、检测快速、操作简便且价格合理，在国际贸易中被指定用于牛、羊、猪布鲁氏杆菌病的检测，适于动物群体布鲁氏杆菌病的普查，也常用于人布鲁氏杆菌病的初筛和监测[7-8]。

2.2.2 试管凝集实验（standard tube agglutination test，SAT） SAT于1897年开始应用，是免疫学方法诊断布鲁氏杆菌病的基石，虽然该方法在发达国家已停用，但目前仍然是我国诊断布鲁氏杆菌病的法定方法[7-8]。SAT准确性高、可以半定量、具有较高的特异性、对IgM敏感性高，用于布鲁氏杆菌的早期诊断；但该方法操作繁琐，需在37℃条件下孵育过夜，耗费时间长，且易出现假阳性和假阴性，不适用于现场疫情的快速筛查[8-9]。

2.2.3 全乳环状实验（protocol of milk ring test，MRT） MRT的本质是抗原抗体的反应，用经染成红色的布鲁氏杆菌作为抗原，当奶样中存在布鲁氏杆菌抗体时，红色的抗原抗体复合物便会转移至乳脂层，从而形成紫红色的乳脂环[7]。MRT主要用于乳样中的布鲁氏杆菌筛查，且世界动物卫生组织规定该方法只能用于奶牛检测。因MRT操作简便快速、检测成本低廉，常用于现场大规模奶牛筛查检测，但该方法敏感性差，在检测牛初乳、发情旺盛期奶牛、接近干奶期的奶牛、患乳房炎的奶牛等均可能会出现假阳性[7-9]。

2.2.4 补体结合实验（complement fixation test，CFT） 主要根据是否发生溶血现象来判断受检血清中有无抗体[10]。CFT是世界动物卫生组织公认的布鲁氏杆菌病确诊性实验，相对于其他血清学检测方法，CFT的特异性强和敏感度高，适用于牛、羊、绵羊附睾种布鲁氏杆菌病的诊断[8-9]。由于豚鼠补体的作用效果会受到猪的补体干扰，使实验敏感性下降38%～40%，因此CFT不适用于猪布鲁氏杆菌病的检测和诊断[7-11]；此外，CFT主要通过肉眼观察溶液颜色的变化来判断溶血程度，结果带有一定的主观性，且该方法实验操作步骤繁琐，对实验人员要求较高，不适宜在基层推广和现场检测[12]。

2.2.5 酶联免疫吸附实验（ Enzyme-linked immuonsorbant assay，ELISA） ELISA相对于其他血清学检测方法而言，其灵敏度高、特异性强，所需样品量少，可以用作确诊实验，同时也可用于大批量样本筛查[13]，在布鲁氏杆菌病诊断中，主要用于血清和乳样中抗体的检测。1976年，Carin-Bastuji等[14]第一次用ELISA检测血清中布鲁氏杆菌抗体，并发现该方法的灵敏度是SAT的10～100倍。目前，ELISA所选用的抗原主要是S-LPS，抗原决定族又主要位于LPS的O链上，但粗糙型布鲁氏杆菌的表面缺乏O链，所以基于LPS-O链的检测方法无法确诊粗糙型布鲁氏杆菌感染引发的布病[13]。虽然ELISA灵敏度高，却不能分辨出接种牛种布鲁氏杆菌或羊种Rev1疫苗产生的抗体和自然感染产生的抗体，故多用于非免疫家畜的筛查；ELISA具有高特异性和高敏感性等优点，于2004年被世界动物卫生组织列为诊断牛种布鲁氏菌病的推荐方法[13-14]。ELISA操作繁琐，需在BSL-2级实验室内进行，不适用于现场快速检测及向基层推广[15]。

2.2.6 胶体金免疫层析技术（colloidal gold immunochromatography，GICA） GICA操作简单，检测时间短（2 min后观察结果，15 min完成检测），对实验人员要求不高，血清样品用量少，且方法特异、灵敏，适用于临床疾病的初步诊断、现场疫情的快速检测和流行病学调查研究，也用于人布鲁氏杆菌病的监测[16]。当用GICA检测组织切片中菌体抗原时，最小检出量为200 CFU/mL，其敏感性略高于ELISA和PCR[17-18]。但是，GICA只能做定性筛查还不能实现定量、质控指标统一以及其灵敏度还需进一步提高[19]。目前，胶体金试纸条市场需求较大，特别是在各医院检验科，因该方法成本低且简便快速，常常作为初筛的手段。

2.3 核酸检测技术

2.3.1 普通PCR（polymerase chain reaction） 目前，普通PCR法检测布鲁氏菌病的引物主要有编码BCSP-31序列的B4/B5、16SrRNA（F4/R2）、外膜蛋白如omp31、 omp10、omp2a、omp2b等[20]。1990年，Feteke等首次应用PCR技术检测布鲁氏杆菌病，表明该方法特异性强，灵敏度高，操作简便，检测时间相对较短，可用于大批量样品的检测[3-5,20]。单对引物的PCR虽然可检出含有布鲁氏杆菌的样品，但不能完全区分鉴别布鲁氏杆菌属的所有生物型。

2.3.2 多重PCR 即在同一反应体系中加入两对及以上的引物，能同时检出多种病原的PCR技术。Bricker等[21]于1994年首次报道了能区分牛种、羊种、绵羊附睾种和猪种布鲁氏杆菌的AMOS-PCR法，该方法能检测到四种布鲁氏杆菌的部分生物型，如牛种的1、2、4型，羊种的3个型，猪种的1型等。1999年，Sreevatsan等[22]根据BCSP31K基因和hsp65基因设计引物，建立了能检测牛奶及牛鼻分泌物中的牛分支杆菌和布鲁氏杆菌的二重PCR。多重PCR具有高效性、系统性和经济简便等优点，能在同一反应管内检测多种病原体，节约了时间和试剂，为临床诊断提供更多的依据[22]。钟旗等[23]应用AMOS-PCR法进一步鉴定布鲁氏杆菌生物型后，发现该方法还可以鉴定犬种布鲁氏杆菌，能区分S19疫苗株和野毒株，表明AMOS-PCR法的特异性和敏感性均高于布鲁氏杆菌的分离培养和血清学方法。此外，彭小兵等[24]于2010年以eri作为布鲁氏杆菌属的特异性基因，同时以IS711基因的拷贝数差异为布鲁氏杆菌种间特异性标志，建立了能同时鉴别羊种、牛种和猪种的三重PCR。虽然多重PCR能同时检测多种病原体，但其引物设计复杂，而且易产生PCR的副产物焦磷酸[22-23]。

2.3.3 实时荧光定量PCR（real-time fluorescence qPCR） Redkar等[25]于2000年根据IS711元件设计了上游引物，根据每个菌种的特异序列设计下游引物，并用荧光标记，由此建立了能特异性检测牛种布鲁氏杆菌、羊种布鲁氏杆菌和猪流产布鲁氏杆菌的实时荧光定量PCR。2005年，Debeaumont等[26]建立了能够检测人血清中布鲁氏杆菌的RT-PCR，结果表明其特异性和敏感性均强于病原的分离培养和血清学方法。实时荧光定量PCR具有高度特异性和敏感性，是目前确定样品中DNA拷贝数最敏感、最准确的方法，它最大的优点在于克服了终点PCR在进入平台期后进行定量带来的误差，实现了DNA或RNA模板的精确定量；此外，实时荧光定量PCR比普通PCR操作简便，不用进行电泳，避免了因扩增产物带来的污染，同时大大缩短了检测时间，在3 h之内即可得出结果[25-26]。由于实时荧光定量PCR需要特殊的检测设备，所用试剂如探针、Mix等比较昂贵，为了避免污染需对实验室进行严格的分区，对实验人员要求较高，所以不适于在基层推广和现场检测[22,27]。

3 展望

目前，世界范围内检测布鲁氏杆菌的方法主要有病原体的分离培养、血清学方法和PCR技术，血清学诊断仍是我国的法定方法。但无论何种方法，都存在某些不足之处，也不能相互取代，到目前为止，还未有单一的方法适用于任何情况下进行快速准确的布病检测。所以，建立一种特异性强、灵敏度高、简便快速、可以同时检测多种病原体并能适用于流行病学调查和大批量样品筛查的检测方法，不仅是时代的需求，也是现代公共卫生需要重点突破的难题。实时荧光定量PCR技术因其特异性强、灵敏度高并能对DNA含量进行实时定量，逐渐被广泛应用。随着检测技术的发展，手携式荧光检测PCR仪的面市，现场检测已可逐步实现，建立起多重实时荧光定量PCR检测方法，不仅能在同一反应体系中同时检测多种病原体，还能节约时间、试剂和费用，大大提高了检测效率。