MicroRNAs对肺癌靶向治疗耐药性的研究进展*

张潘红，邱志宏，崔家骏

（宜春学院 1.化学与生物工程学院，2.医学院，江西 宜春 336000）

肺癌是全球范围内癌症相关死亡的主要原因，大多数肺癌患者就诊时已处于晚期[1]。具有生物导弹之称的靶向治疗使肺癌的治疗获得很大的进步，但随着治疗时间延长，肺癌细胞对靶向药物产生耐药性，严重影响肺癌的治疗效果[2]。研究发现，异常表达的MicroRNAs（miRNAs）在肺癌细胞对分子靶向药物产生的耐药性中发挥重要作用，是形成耐药性的潜在靶点[1，3]。因此，迫切需要揭秘miRNAs 在分子靶向药物产生耐药性中的作用。

1 miRNAs 生物学功能

1993年人类首次在秀丽隐杆线虫中发现miRNAs，其是一个长约20 ～22 个核苷酸的小分子非编码片段RNA，几乎参与每个细胞生物过程，比如细胞的增殖、分化、迁移、转移、新陈代谢及死亡等，对动物发育和体内稳态维持也起到至关重要的作用。miRNAs 生物发生因子Dicer 9 和Drosha 10 的缺失，是小鼠胚胎致死的重要危险因素[2，4]。AGO 是一个庞大的蛋白质家族，主要以单链小核酸为作用靶点，诱导RNA或DNA 中的互补序列发生沉默[5]。miRNAs 主要通过诱导AGO 蛋白与mRNA 的3'非翻译区结合，形成miRNAs 诱导沉默复合物，促进mRNA 的降解和翻译抑制[6-7]。越来越多的研究发现，miRNAs 的功能失调与人类许多疾病发生和肿瘤细胞耐药性形成密切相 关[8]，例如根据不同作用靶点，miRNAs 可作为癌基因或肿瘤抑癌基因在癌症的发生和进展恶化中发挥作用[9]。目前，一些miRNAs 已成为诊断癌症、判断癌症患者预后及新型癌症治疗的靶标[10]。

2 miRNAs 与肺癌靶向药物耐药性的关系

2.1 miRNAs 与EGFR 酪氨酸激酶抑制剂的关系

表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor,EGFR）是ErB/HER 酪氨酸激酶受体家族成员之一，其与配体结合后，导致重要的构象变化，引起细胞内酪氨酸残基磷酸化，活化下游信号转导蛋白，调节细胞生长、侵袭、凋亡及转移。EGFR 突变存在于许多恶性肿瘤中，是预测非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）患者治疗反应的突出指标[11]。吉非替尼和厄洛替尼是第一代EGFR-酪氨酸激酶抑制 剂（epidermal growth factor receptor-tyrosine kinase inhibitors,EGFR-TKIs）最具代表性的药物，主要针对具有EGFR 突变的肺腺癌患者，通过阻断三磷酸腺苷与胞内酪氨酸激酶的结合，抑制酪氨酸残基磷酸化，阻止下游信号转导，从而有效抑制肿瘤细胞增殖。常与西妥昔单抗联合治疗EGFR 功能突变的肺腺癌，效果显著，但最终会因耐药性的产生，削弱这类药物的细胞杀伤作用，导致靶向治疗失败[12]。

异常表达的miRNAs 与肺腺癌细胞EGFR 突变有关，严重影响肺腺癌细胞对吉非替尼的敏感性，参与肺腺癌细胞对EGFR-TKIs 耐药性的调节。2009年CHOW 等[13]对10例非吸烟患者肺腺癌组织和癌旁正常肺组织进行miRNAs 基因芯片和qRT-PCR 分析，发现miR-145、Let-7 及miR-126 在肺腺癌中低表达。EGFR基因序列分析实验结果显示，10例肺腺癌中有7例存在EGFR突变。转染细胞活力检测实验发现，在正常细胞、无EGFR突变细胞及EGFR突变细胞中，分别转染3 种miRNAs 前体，结果EGFR突变细胞的存活率降低40%，而其他两组细胞存活率无变化。这些结果证实miR-145、Let-7 及miR-126 对肺癌细胞生长具有抑制作用。2011年CHOW 等[14]又通过实验证实，miR-145 表达下调与肺腺癌细胞EGFR突变有关，且异常表达的miR-145 可通过抑制靶基因EGFR的表达，提高吉非替尼的细胞毒性作用，抑制肺腺癌细胞生长。同样以EGFR为靶基因，调节细胞生长的还有miR-146a，其可通过靶向EGFR，抑制下游信号传导，调节细胞生长，还可增强NSCLC 中EGFR 酪氨酸激酶抑制剂和单克隆抗体的细胞毒性[15]。

2.2 miRNAs 与抗血管生成剂的关系

血管生成在肿瘤生长、侵袭及转移中起重要作用[16]。血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）是刺激肿瘤血管生成的重要因素，与血管内皮细胞特异性结合，促进肿瘤新生血管形成，增加血管通透性，促进肿瘤细胞转移，是最重要的刺激新生血管形成的因子，在恶性肿瘤中高表达[17]。因此，如何利用VEGF 阻断血管形成，抑制肿瘤生长成为近十年来分子靶向药物研究的热点之一[18]。目前，临床常将抗血管生成素与化疗药物联合使用，以提高恶性肿瘤的化疗效果，例如贝伐单抗与紫杉醇-卡铂联合治疗方案，提高NSCLC 的整体存活率[19]。目前，笔者对抗血管生成素的研究取得可喜的成绩，但对VEGF如何阻断血管形成的具体分子机制研究，仍然存在很多问题，其中包括miRNAs 对VEGF 信号通路的具体作用研究。

VEGF 及其受体FIT-1 和KDR 是形成VEGF 信号通路的主要成分[20]。CHAN 等[21]于2011年发现，异常表达的miR-200b 具有抑制内皮细胞迁移和新生血管形成的功能。同年CHOI 等[20]发现，miR-200b在顺铂耐药的肺癌A549 细胞中表达下调，使用脂质体RNAi MAX 将人工合成的miR-200b 转染细胞后，VEGF、FIT-1 及KDR 蛋白表达降低。血管生成实验发现，血管内皮细胞在基底膜形成毛细血管的能力也降低。双荧素酶分析实验结果显示，VEGF、FIT-1 及KDR 是miR-200b 的作用靶点，进一步验证miR-200b是通过VEGF 信号通路发挥抑制作用。这一系列的实验结果最终证实，miR-200b 是通过负调控VEGF、FIT-1 及KDR 在肿瘤血管形成中发挥作用。近年来研究发现，miR-126 也具有抑制肿瘤生长、侵袭及转移的能力，并通过靶向VEGF-A 提高NSCLC 对抗肿瘤药物的敏感性[22]。因此，深入了解miRNAs 与VEGF 信号通路的关系不仅有助于抗血管生成剂的研究，而且对提高肿瘤细胞药物敏感性也至关重要。

2.3 miRNAs 与TRAIL 诱导细胞凋亡抗性的关系

肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（tumour necrosis factor-related apoptosis inducing ligand,TRAIL）是肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor,TNF）超家族成员之一，也是TNF 家族中抗肿瘤活性最强的因子之一，能选择性诱导肿瘤细胞凋亡，但对正常细胞无细胞毒性，受到国内外学者的广泛关注[23]。TRAIL 与细胞膜表面的死亡受体TRAIL-R1（DR4）和TRAIL-R2（DR5）相互作用，诱导死亡受体与Fas 蛋白的相关死亡结构域（fas-associated death domain,FADD）结合，促进FADD 与Procaspase-8 结合，活化凋亡通路关键蛋白Caspase-8，诱导细胞凋亡[24]。或者TRAIL与受体结合后，经TNF 相关受体-1（tumor necrosis factor receptor-1,TNFR1）、TNFR1 相关死亡结构域（TNFR1-associated death domains,TRADD）及TNF 受体相关因子2（TNFR-associated factor 2,TRAF2）激活核因子kB（nuclear factor-kappa B,NF-kB），发挥促凋亡作用。但越来越多的研究发现，多种肿瘤细胞对TRAIL 诱导的细胞凋亡作用耐药，且TRAIL 重复作用导致一些敏感细胞对TRAIL 产生获得性耐药，成为影响TRAIL 治疗效果的主要障碍。

miRNAs 在TRAIL 诱导的细胞凋亡抗性中发挥重要作用。GAROFALO 等[25]于2008年在TRAIL 耐药性NSCLC 研究中发现一种位于X 染色体短臂且具有共同调控机制的新型miRNAs：miR-221 和miR-222，并以其作为研究对象，探索TRAIL 耐药性机制。研究发现，与TRAIL 敏感的H460 细胞系相比，miR-221 和miR-222 在TRAIL 耐药细胞、中度耐药的A459 细胞和A549 细胞中表达升高。转染miR-221和miR-222 抑制剂后，TRAIL 耐药细胞对TRAIL 诱导的细胞凋亡敏感，而转染miR-221 和miR-222 前体的TRAIL 敏感细胞，则对TRAIL 诱导的细胞凋亡失敏，出现耐药表型。同时使用寡核苷酸芯片技术对TRAIL 耐药细胞进行基因表达谱分析，发现关键蛋白Kit 和P27kip 表达下调，进一步的深入研究最终证实，miR-221 和miR-222 是通过抑制关键蛋白Kit和P27kip 的表达，破坏肿瘤细胞中TRAIL 的功能，抑制细胞凋亡。细胞外信号调节激酶（extracellular regulated signal kinases,ERK1/2）的激活在细胞信号传导和癌症的发生、发展中发挥重要作用。GIULIA 等[26]于2012年在NSCLC 中发现miR-494 受ERK1/2 调节，抑制ERK1/2，miR-494 表达降低，BIM 表达增加。并证实异常表达的miR-494 通过下调BIM 的表达，抑制TRAIL 诱导的细胞凋亡。

2.4 miRNAs 与ALK-TKIs 抑制剂的关系

2.4.1 间变淋巴瘤激酶基因突变 在NSCLC 中，4% ～7% 患者存在间变淋巴瘤激酶（anaplastic lymphoma kinase,ALK）基因重排现象，也称ALK突变[27]。该突变发生在2 号染色体短臂，常与棘皮类微管相关样蛋白4（echinoderm microtubule-associated protein-like4,EML4）基因结合，形成具有癌基因特性的EML4-ALK[28]。克唑替尼是第一代口服的小分子间变淋巴瘤激酶-酪氨酸激酶抑制（anaplastic lymphoma kinase-tyrosine kinase inhibitors,ALK-TKIs），广泛应用于ALK 突变的局部晚期或转移性NSCLC 患者，效果比传统的化疗药物好，且对ROS1基因重排的NSCLC 患者也有很好的效果[29]。但在长期的治疗过程中，肺癌细胞对克唑替尼产生的获得性耐药，大大降低克唑替尼的抗肿瘤作用。

研究发现，miR-200 家族与许多类型肿瘤细胞的增殖、侵袭、转移及耐药性的产生密切相关，miR-200c 是miR-200 家族的重要成员，在许多恶性肿瘤组织中低表达[30]。上皮间质转化（epithelial-mesenchymal transition,EMT）具有促进肿瘤免疫抑制和胚胎发育期组织重塑的作用，还参与组织愈合和器官纤维化，是肿瘤转移、侵袭中必不可少的早期步骤[31]。2008年GREGORY 等[32]的研究发现，在乳腺癌细胞中，miR-200c 可通过介导靶基因ZEB1和SIP1的表达抑制EMT。同年PARK 等[33]也发现，miR-200 家族通过介导靶向E-钙黏蛋白抑制因子ZEB1和ZEB2调节EMT，抑制肿瘤细胞的侵袭、转移。2016年GAO 等[34]再次证实，ZEB1是miR-200c 调节EMT 的直接靶基因，并且发现miR-200c 在克唑替尼耐药细胞（NCI-2228/CRI）中表达降低。为揭秘miR-200c 和EMT对ALK突变的肺癌细胞产生克唑替尼耐药性的影响， GAO 等[34]将miR-200c 模拟物转染入NCI-2228/CRI中，通过qRT-PCR 和Western blotting 实验结果发现，miR-200c 表达增加，间充质标志物N-钙黏蛋白、波形蛋白及CD24 的表达降低，表明高表达的miR-200c逆转EMT；同时MTT 实验结果显示，NCI-2228/CRI对克唑替尼重新致敏。这些结果最终证实，miR-200c通过抑制靶基因ZEB1的表达逆转EMT，提高克唑替尼耐药的ALK 突变肺癌细胞对克唑替尼的敏感性[32-34]。此外，miR-150 增强克唑替尼耐药性骨肉瘤细胞对克唑替尼的敏感性，提高克唑替尼的抗肿瘤作用[35]。

2.4.2 ROS原癌基因1重排ROS原癌基因1（ROS proto-oncogene 1,ROS1）重排非常罕见，约占0.6% ～1.8% NSCLC 患者[36]。1987年BIRCHMEIER等[37]在45 种不同人类细胞系的调查研究中，首次在神经胶质母细胞瘤中发现ROS1基因重排。2007年RIKOVA 等[38]在肺腺癌中同样发现位于染色体6q22位点的ROS1基因重排，该基因能编码一种属于胰岛素受体家族的受体酪氨酸激酶。研究发现，ROS1与ALK具有部分同源性，重排的ROS1基因以与ALK 异常激酶活性相似的方式，激活致癌途径下游的信号转导，促进肺癌细胞的增殖、迁移及凋亡[39-40]。SHAW等[41]在对50例晚期NSCLC 患者使用克唑替尼治疗效果的评估中发现，克唑替尼对ROS1基因重排阳性的NSCLC 患者显示出很好的治疗效果，证实克唑替尼可通过瞄定ROS1基因重排，实现对ROS1基因重排阳性NSCLC 患者的靶向治疗。

YAN 等[42]研究发现，在NSCLC 中，与邻近正常的肺组织相比，miR-760 表达降低，ROS1 介导的蛋白表达升高，且两者呈负相关。随后将miR-760 模拟物转染入A459 细胞中，发现高表达的miR-760 抑制肺癌细胞的增殖和迁移。通过TargetScan 系统和荧光素酶报告基因实验证实，ROS1基因是miR-760 的直接靶基因。为进一步确定miR-760 是通过介导靶基因ROS1，抑制肺癌细胞的增殖和迁移。将ROS1高表达质粒转染入高表达miR-760 的A549 细胞中，发现异位表达的ROS1 促进A549 细胞的增殖，降低miR-760 抑制A549 细胞迁移的作用。这些结果最终证实，miR-760 通过靶向ROS1抑制NSCLC 的增殖和转移。但至今为止，并没有关于miRNAs 与ROS1基因重排的NSCLC 对克唑替尼耐药的研究报道。因此，未来研究miRNAs 在肺癌细胞对ALK-TKIs 耐药性中的作用，将有望成为治愈ALK 阳性和ROS1基因重排的NSCLC 的新靶点。

3 展望

近年来，随着人们对肺癌分子生物学和基因组学的不断深入研究，越来越多的新靶向治疗药物应用于肺癌，使肺癌的治疗获得很大的进步。但由于分子靶向药物耐药性的出现，肺癌仍然是全世界发病率和病死率最高的恶性肿瘤。然而，miRNAs 与肺癌治疗进展和肺癌细胞耐药性之间的复杂关系，为学者攻克分子靶向药物耐药性提供了帮助；为完善分子靶向治疗和分子靶向药物的开发，指明了新方向。目前，笔者在miRNAs 与肺癌治疗进展和肺癌靶向药物耐药性方面的研究取得丰硕的成果，但仍然存在一些研究空白，比如miRNAs 在NSCLC 对ALK-TKIs 耐药性的研究。这些研究的空白，是激励学者不断研究探索miRNAs奥秘的动力，揭秘miRNAs 在肺癌治疗进展中的重要作用；同时也是ALK-TKIs 抗性NSCLC 患者治愈的希望。未来如何更好地利用具有逆转耐药性的miRNAs，抑制那些诱导靶向药物耐药性的miRNAs，是正确选择个体化治疗的重要一环；也是提高肺癌患者对靶向药物利用率，减轻患者痛苦、延长患者生命的钥匙。