丁酸梭菌及其饲用菌制剂的研究与开发

张吉

（1.湖北博大生物股份有限公司，湖北 黄石 435000；2.江西省农业科学院畜牧兽医研究所，江西 南昌 330200）

丁酸梭菌（Clostridium butyricum），全名丁酸梭状芽孢杆菌（Clostridium butyrate bacillus）， 又 名丁 酸菌（Butylic acid bacteria）、 酪酸菌（Butyric acid bacteria）、酪丁酸梭菌（Clostridium tyrobutyricum）、 宫 入菌（Clostridium butyricum Miyairi）， 为芽孢杆菌科（Bacillaceae）、梭菌属（Clostridium）[1]严格厌氧的革兰氏阳性产芽孢短杆菌，菌体中常有圆形或卵圆（椭圆）形芽孢，偏心或次端生，可抵御不良环境，广泛分布于人和动物的肠道、粪便，奶酪、酸奶、酒窖泥，以及土壤、树叶等自然环境中[2]，细菌学分类属于厚壁菌门（Firmicutes）、梭菌纲（Clostridia）、梭菌目（Clostridiales）、芽孢杆菌科（Bacillaceae）、梭菌属（Clostridium）[3]。

1 丁酸梭菌的发现、发展简史

1.1 丁酸梭菌在国外的发现、分离与产业化

丁酸梭菌之所以又名宫入菌，是因为丁酸梭菌最先由日本千叶医科大学宫入近治博士首先于1933年发现并报道的[4]。俄罗斯微生物研究所的Kingi miyairi博士于1935年从健康人的粪便与土壤中分离出丁酸梭菌，并从丁酸梭菌厌氧培养的过滤物中发现含有乳酸、丁酸等短链脂肪酸[3]。这些短链脂肪酸具有较强的调理肠道功能，也就是整肠作用，即能够调整肠道液体的分泌（抑制肠液的过量分泌，促进肠液的吸收），减少肠内的水分含量，也就相应地减少了大便中的水分，从而抑制腹泻；同时还能够促进肠道中如双歧杆菌、乳杆菌等益生菌的生长，抑制肠道中的致病菌的生长，维持肠道菌群平衡，提高机体免疫功能，增进动物健康，促进动物生长。日本于1944年成功研制出可用于临床的丁酸梭菌制剂，该制剂克服了双歧杆菌、乳酸菌等益生菌制剂室温存活率与胃酸中通过率低、不产丁酸、治疗效果慢的缺点，能够广泛应用于诸如急、慢性肠炎引起的腹泻、非溃疡性消化不良、肠易激综合症以及各种原因（肠道感染、外科手术等）所致的肠道菌群紊乱等肠道疾病的治疗，且疗效稳定，有效率达90%以上，尤其是对使用抗生素后所致的伪膜性肠炎有着独特的效果，很快成为该领域的国际垄断产品[3,5-6]。从此，丁酸梭菌制剂在日本开始作为调理人体胃肠功能的整肠药一直使用至今。

1.2 我国对丁酸梭菌的引进、自主创新与产业化

我国的黑龙江省科学院微生物研究所，于1992年自俄罗斯微生物研究所引进丁酸梭菌，并在中国定植。我国自1993年起，自日本进口丁酸梭菌制剂，先后在上海、广州、哈尔滨等十几家著名医院用于治疗肠道菌群紊乱引起的肠炎、腹泻、消化不良等疾患，疗效显著。我国从1996年开始研制能替代抗生素治疗顽固性肠炎、腹泻，预防肠病并发症及肠癌的微生态生物药物，并列入国家863重点攻关项目，项目主持人为留学归国人员、著名医学微生态专家崔云龙博士。崔云龙博士及其领导的团队，历经2年多的时间，自偏远山岭、荒野采集的2万份样品中筛选出50多个新菌种，几经比较，最后筛选出丁酸梭菌CGMCC313-1菌株。这是我国第一株治疗腹泻、肠炎、阻止肠恶变的药用丁酸梭菌菌株。经过中国药品生物制品检定所反复检验，论证其综合性状远超国际同类菌种。随后，又经3年多的研究、历经2万多次试验，逐一攻克了丁酸梭菌的高产量发酵技术、低温分离技术、制剂技术以及常温保存技术等关键技术。他们运用自主研发的发酵工艺，丁酸梭菌的产量每毫升含菌量达到1亿个、芽孢比例达到95%，这是目前可查到的国际专利数据的100倍，临床研究结果也证实其疗效超过同类的日本产品。2003年10月开始该项成果的产业化，2004年试产成功，并成功实现了产业化生产，拓开了市场，从而彻底打破了日本半个多世纪以来对该技术的垄断。目前，丁酸梭菌已普遍应用于人的肠道疾病。特别值得指出的是，崔云龙团队成功发明的常温条件下长期保存丁酸梭菌活性技术，标志着我国成为当今世界上在微生态生物制剂领域里掌握着该核心技术的唯一国家。与此同时，崔云龙团队还成功研制出其他能够治疗肠道菌群失调、恢复肠道健康，具有一定活性的微生态制剂。例如，药用凝结芽孢杆菌TBC-169菌株。这是一株药用价值很高的优秀菌株，能选择性促进肠道双歧杆菌等益生菌的生长繁殖，并分泌抗菌凝固素，对7种肠道致病菌的生长繁殖有较强的颉颃与抑制作用。我国因此成为世界上第二个具备该制剂生产技术的国家。

1.3 丁酸梭菌作为饲料添加剂在我国的开发与应用

1.3.1 丁酸梭菌被批准用作畜禽饲料添加剂

我国原农业部于2006年将丁酸的钠盐- 丁酸钠（Sodium Butyrate）列入《饲料添加剂品种目录》。丁酸钠产品应用于动物饲料中，主要是发挥其胃肠道微生态调节剂、肠黏膜营养剂、电解质平衡调节剂、复合酸化剂、诱食剂以及香味剂等作用。2009年7月，我国原农业部正式批准丁酸梭菌制剂作为新饲料添加剂，可在包括养猪业在内的畜牧生产上使用[7]，这极大地推动了丁酸梭菌作为饲料添加剂在我国的研究与应用。

1.3.2 我国成功研制出可作为饲料添加剂的丁酸梭菌

我国研究者对丁酸梭菌的研究主要是在人的医学临床应用上，但作为饲料添加剂的应用研究，也就是近几年的事。

赵建新等于2002年，自健康人的粪中分离到4株丁酸梭菌并对其进行安全性评价，发现其中的丁酸梭状芽孢杆菌Z-10菌株可用作生产饲用益生菌[8]。浙江惠嘉生物科技有限公司最先研制出可用作饲料添加剂的丁酸梭菌，并于2009 年11月，获得了原农业部颁发的全国首个益生菌方面的饲料添加剂新产品证书，同时获得新产品证书的还有该公司生产的地衣芽孢杆菌。此后，浙江惠嘉在这两个产品基础上，相继增加了多种芽孢杆菌、乳酸菌和微生物代谢产物，形成了一个系列的益生菌制剂产品，在全国乃至世界范围推广[9]。2016年3月，江苏三仪生物产业集团制定的丁酸梭菌及新型复合酶制剂企业质量标准通过验收，这为三仪集团申报以丁酸梭菌为主的单一型与混合型饲料添加剂以及酶制剂的生产资质奠定了基础[10]。

近年来，我国的有关大专院校、科研院所以及企业加大了丁酸梭菌作为饲料添加剂的研发，成果已在动物养殖领域应用。然而，就整体而言，将丁酸梭菌成功地商业化用作畜禽水产饲料添加剂，目前还多是韩国、日本等少数几个厂家生产的丁酸梭菌制剂。

2 丁酸梭菌的生物学特性

2.1 丁酸梭菌是一个集芽孢杆菌与乳酸菌优点于一身的天然绿色菌种

丁酸梭菌既能像芽孢杆菌那样具有诸如耐热（常温下易保存）、耐胃酸、耐胆盐等抗逆性，又能像乳酸菌那样在肠道厌氧环境下生长、并产生乳酸，特别是还能产生丁酸；既克服了芽孢杆菌在肠道这样的厌氧环境下，不能很好地生长、且不产乳酸的缺点，又克服了乳酸菌耐热性差，室温存活率低，在常温下不易保存、65～75 ℃下即死亡，在生产乳酸菌制剂过程中死亡率高，不适于在制粒饲料中添加，胃酸通过率低，且不能产生丁酸的缺点；所以，丁酸梭菌是一个集芽孢杆菌与乳酸菌优点于一身的极具潜力的饲用益生菌。丁酸梭菌无毒副作用，不存在毒力返强的风险，既可用作饲用益生菌种，又可用作治疗药物；既像食品一样安全，又像药品一样有效（针对慢性腹泻、肠炎等肠道疾病）；打破了 是药三分毒 的传统观念，是真正安全的天然绿色菌种。丁酸梭菌制剂是刚刚起步且极具潜力的饲用益生菌制剂[11]。

2.2 丁酸梭菌的抗逆性强

丁酸梭菌由于能够生成芽孢，因而具有耐热、耐酸、耐盐、易保存的生理特征。特别丁酸梭菌所生成的芽孢为内生芽孢，使得其具有较强的抗逆性，表现在：1）耐热。丁酸梭菌制剂经80 ℃、30 min和90 ℃、10 min热处理后的存活率为98%；经90 ℃、20 min热处理后的存活率为95%；经100 ℃、5 min热处理后的存活率仍高达80%。因此，丁酸梭菌足以耐受饲料制粒过程中的高温、高热工艺；2）耐酸。丁酸梭菌在pH为1.0～5.0时仍能存活，同时丁酸梭菌对pH的适应范围较广，在pH为4.0～9.8时仍能适合其生长；3）耐酸、耐盐、耐胆汁。无论是动物胃肠道环境还是人工胃液、肠液和胆盐，丁酸梭菌都具有良好的耐受性，能在其中存活，进入动物肠道后亦能够存活生长；4）耐干燥。丁酸梭菌的固体活菌制剂，在干燥、室温环境下保存3年以上，活菌数未见减少[12]。饲用丁酸梭菌制剂中的活菌是以芽孢形式存在的，因而能够适应肠道的产酸、产胆汁盐的厌氧环境，发挥调节菌群平衡的功能，并能够顺利地通过饲料生产（含制粒）加工，这样就基本满足了绿色益生菌制剂产业化的全部需求。

2.3 丁酸梭菌在动物肠道内的五大生物学特性

丁酸梭菌作为饲用益生菌种，在动物肠道内呈现出五大生物特性：1）丁酸梭菌作为厌氧芽孢杆菌，不受胃酸、胆汁酸等影响；2）丁酸梭菌产生的丁酸、乳酸，能够促进动物肠道中乳酸菌、双歧杆菌等有益菌群的增殖与发育，抑制肠道内有害菌和腐败菌的生长、繁殖，纠正肠道菌群紊乱，调节肠道微生态平衡，减少肠毒素的产生；3）丁酸梭菌在动物肠道内产生的淀粉酶、纤维素酶、蛋白酶等消化酶以及B 族维生素、维生素K等维生素，这些物质连同丁酸等对动物具有营养保健作用[13]；4）丁酸、乙酸、氢气等丁酸梭菌的代谢产物，能够减轻肠道炎症，加速肠道损伤修复，尤其是主要代谢产物丁酸，它是肠道上皮组织细胞再生和修复的主要营养物质[14-15]；5）对多种饲用抗生素具有较强的耐受性，可以与之配伍使用。由此可见，丁酸梭菌作为饲用益生菌，集芽孢杆菌与乳酸菌的优点于一身，既具有优良的生产性能，又具有耐热、易贮藏、适应动物肠道微生态环境（厌氧、酸、胆盐）的特性，对于减少当前动物生产中饲用抗生素的滥用、减少药物在肉、蛋、乳等畜禽产品中的残留、降低动物细菌的耐药性与保障动物健康方面有着重要的意义，是一个极具潜力的饲用益生菌种，有着广阔的市场前景。

3 丁酸梭菌的组合应用

3.1 丁酸梭菌与益生菌的组合应用

不同的益生菌制剂，有着不同的作用机制与途径，解决的问题也不尽相同。仅凭某个单一的益生菌制剂，通常很难完全满足养殖动物的生理要求。根据具体的养殖品种，将相互促进发挥协同作用，而不是相互颉颃产生抑制作用的几种益生菌在正组合效应基础上，按照一定比例配伍制成协同共生、优势互补的复合益生菌制剂，就能发挥出比单一菌制剂更显著的应用效果，共同完成对动物的营养调控作用。丁酸梭菌作为饲用益生菌，既可单独添加，也可与一些益生菌配伍使用，以发挥益生菌群间互作的正组合效应。例如，将丁酸梭菌与地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌进行集成，组合成一个具有多种功能的绿色 三酵菌 制剂，能较好地解决动物的肠道健康问题，从而在动物生产中少用或者不用抗生素。鉴于肠球菌易产生耐药性、移位及室内感染，世界卫生组织建议在复合益生菌制剂中不应含有肠球菌，我国目前虽然还没有这方面的明确规定，在选择与丁酸梭菌配伍的益生菌时，还是应尽量避免选用肠球菌[7]。目前，在养猪生产中常见的与丁酸梭菌配伍的几个菌种组合，如应用于断奶仔猪的丁酸梭菌与戊糖片球菌、植物乳杆菌、酵母菌、枯草芽孢杆菌配伍组成的复合菌剂。

3.2 丁酸梭菌与其他营养活性物质的配伍使用

丁酸梭菌或其复合益生菌制剂与：1)益生元、酶制剂、中草药制剂等的配伍；2)酸化剂、益生素、中草药提取物等的配伍；3)复合酶制剂（包括蛋白酶、淀粉酶、β-甘露聚糖酶、木聚糖酶与单宁酶）的配伍；4)酵母细胞壁和核苷酸的配伍；5)低聚木糖等的配伍。

3.3 丁酸梭菌与抗生素的组合应用

1)由于丁酸梭菌对链霉素、红霉素、强力霉素、氨苄青霉素、洁霉素、羟氨苄青霉素、沙交霉素、磺胺甲硝唑、头孢立新、阿米卡星、环丙沙星、多黏菌素E等多种抗生素，尤其是吡哌酸与氨基糖苷类抗生素具有抗性，对这些抗生素不敏感，故丁酸梭菌作为兽药在与这些抗生素联合使用时，其生物功能不仅不受影响，还能加强抗生素的治疗效果，减少抗生素的用量，避免长期大量应用抗生素给动物及人类的健康带来危害；2)丁酸梭菌的这种对多种抗生素的抗性，对其在目前普遍添加有抗生素的饲料中，而养殖场又滥用抗生素的情况下，仍能发挥其功效有着特殊意义；3)丁酸梭菌并不是对所有抗生素都有抗性或不敏感，丁酸梭菌与抗生素组合应用时，不能与氯霉素、先锋霉素、新生霉素、万古霉素、林可霉素、替硝唑、甲硝唑、氨苄西林、四环素等组合使用，因为丁酸梭菌对这些抗生素不具抗性[11]。

4 导致饲用丁酸梭菌等益生菌制剂效果不稳定的因素

上面阐述的丁酸梭菌的诸多优点，是在严格控制试验条件下所得到的研究结果，与商业大规模生产的条件相比，还存着较大差距。这就是动物饲料中添加饲用丁酸梭菌等益生菌制剂，有时效果不明显，甚至完全没有效果的原因，这不完全是丁酸梭菌等益生菌制剂自身的问题，下列情况下即使使用品质好的益生菌制剂，也不一定能表现出好的效果：1)丁酸梭菌等益生菌制剂在动物生产中的应用，重在维持肠道健康、防病与促生长，不在治病，疗效不如抗生素那样迅速很正常；2)一些饲料其营养水平配制已较高，添加丁酸梭菌等益生菌制剂的效果就不一定显著。而在营养水平较低的日粮中添加丁酸梭菌等益生菌制剂，其效果就比在营养水平较高的日粮中添加显著。较高的营养水平配制，典型的例子有：①日粮已添加酸化剂、植物提取物、植物精油、寡糖等任何一种添加剂的饲料或其组合物；②已添加功能脂肪（ω-3多不饱和脂肪，具抗氧化、抗应激功能）、动能脂肪（中链脂肪特别是OPO（1，3-二油酸2-棕榈酸甘油三酯）脂肪，能够为哺乳仔猪快速补充能量，快速恢复体能）的哺乳仔猪日粮；③添加有优质桑叶粉（粗蛋白高于28%）的断奶仔猪日粮，因为桑叶亦具有抑制肠道金黄色葡萄菌、大肠杆菌等致病菌，促进肠道乳酸菌、双岐杆菌等益菌生长的功能，从而通过调节肠道菌群数量维持动物肠道菌群平衡的功能；3)菌株宿主源性造成的差异，即来源于猪肠道分离的菌株，其对猪的效果明显而对鸡则未必有效，所以不同来源的丁酸梭菌菌株及其复合菌制剂以及其他益生菌制剂，应根据其菌株来源而选择最适合的使用对象；4）动物在不同生长期，其对益生菌的需求不同。初生动物由于肠道菌群尚未建立或处于不稳定状态，此时饲喂丁酸梭菌等益生菌要比后期肠道已建立起相对稳定的菌群后使用益生菌的效果明显；5）就哺乳动物而言，因断奶前后日粮的差异，造成肠道中营养物质的差异，结果导致所需的益生菌群差异，这就要求差异性地供给动物适用的益生菌（含与丁酸梭菌配伍的不同专用菌）；6）环境条件较差时，给生产动物饲喂丁酸梭菌等益生菌的效果要显著得多，这是因为所饲喂动物的肠道内的菌群组成缺乏有益菌或肠道内存在着反作用菌（即抑制生长的菌）时，饲喂丁酸梭菌等益生菌的效果更明显；而当动物自然接种了大量有益菌或其肠道内不存在反作用菌时，饲喂丁酸梭菌等益生菌的效果则不明显；7）尽管丁酸梭菌对大部分抗生素具有抗性，但并不是对所有的抗生素均有抗性，特别是：一方面，配合饲料中添加的亚治疗量抗生素，远超丁酸梭菌的耐受性剂量；另一方面，与丁酸梭菌配伍的其他益生菌对抗生素敏感，因此在添加饲用丁酸梭菌等益生菌制剂时，还是要注意饲料中所添加的抗生素的品种及其含量；8）由于丁酸梭菌等益生菌菌株间存在着血清型的周期性变异，滞留在肠道中的菌株能否继续存在，还取决于其竞争性争夺肠黏膜结合位点的能力。因此，丁酸梭菌等益生菌应持续在饲料中添加使用。

5 存在问题与展望

当前，开发利用丁酸梭菌所存在的问题及其改进方法：1）丁酸梭菌是极其严格的厌氧菌，发酵生产的得菌率低，限制了它的广泛应用。特别是由于不同生产厂家的菌株来源及发酵水平的差异，导致市场产品质量参差不齐，使用效果贬褒不一。今后除须进一步加强丁酸梭菌生产工艺的研究外，还要优化出更适合丁酸梭菌生长的培养基；2）目前，对于丁酸梭菌及其代谢产物在动物体内的代谢过程、作用机制尚未彻底明了，只有全面、深入地掌握了其具体的作用机理，才能更好地发挥丁酸梭菌的作用；3）丁酸梭菌与其他益生菌配伍的组合效应及其机理有待进一步深入研究；4）丁酸梭菌在不同动物及同一种动物不同阶段、生理状态的适宜添加量研究；5）利用基因工程技术，对现有丁酸梭菌进行改造，以期获得更加优良的菌种。例如，鉴于丁酸梭菌是一种适合于木质纤维素同步糖化发酵生产丁酸的菌种，可以利用阿拉伯糖、葡萄糖、纤维二糖、木糖等多种底物进行发酵产酸（主要发酵产物为丁酸和乙酸）。将丁酸梭菌乙酸发酵关键基因取代为丁酸发酵关键基因来构建突变株，可增加突变株的丁酸发酵产量，减少乙酸的发酵量。Niall等[16]分别将来源于丙酮丁醇梭菌的丁酸代谢关键酶基因- 乙酰乙酰辅酶A转移酶基因(thl)、来源于丁酸梭菌本身的乙酸代谢关键酶基因片段- 磷酸转乙酰基酶基因片段(pta)和来源于质粒pIMP1的红霉素抗性基因(em)。将它们与质粒pUC19相连构建为非复制性质粒pUC19-EPT。通过电转化将其导入丁酸梭菌中。再利用红霉素抗性平板筛选获得转化子，通过PCR验证发现：获得的突变株染色体上pta被thl替换。在以葡萄糖为底物的发酵中，突变株丁酸得率为0.47，较野生型增长了34%，乙酸得率为0.05，较野生型下降了29%。这为新型丁酸梭菌基因工程菌的构建提供了借鉴。