家蚕抗性基因细胞色素P450的研究进展

●高瑞娜（朔州职业技术学院 山西 朔州 030006）

家蚕是一种产丝昆虫，由于其具有重要的经济价值、详尽的分子生物学和遗传学研究背景，现已成为重要的模式生物[1]。但是，随着工业、城市以及农业环境的污染加剧，如氟化物、工业粉尘、杀虫剂及饲料添加剂的滥用等，严重影响了家蚕的正常生长发育，使丝绸行业遭到了巨大的威胁。在长期的人工驯化过程中，家蚕的抗逆能力逐渐下降，对外界刺激物的耐受力减弱，因此，提高家蚕的抗逆性和抗病性成为近年来的研究热点之一。

细胞色素P450加单氧酶是重要的代谢酶系，不仅涉及一系列的内源代谢复合物如激素、脂肪酸、幽类化合物和维生素等的代谢，也涉及对外源复合物如药物、环境污染物、化学制品、杀虫剂以及植物毒素等多种化合物的代谢[2，3]，是昆虫体内三大解毒酶家族之一[4]，对昆虫抗性起着十分重要的作用，同时对其生长发育有着非常关键的功能。在基因进化过程中，与代谢抗性相关的基因趋向于和昆虫特殊的生长环境及取食习性相适应，而与昆虫生长发育相关的基因功能则相对保守稳定[5]。本文以期通过对家蚕在各种外界刺激下的诱导表达进行综述，为加强P450基因参与昆虫反防御机制的研究、推动害虫治理向分子水平的技术进步提供更科学合理的理论指导。

1 对植物次生物质的诱导表达

家蚕主要以桑叶为食料，而桑叶中含有较高的槲皮素、芦丁、芸香苷和生物碱等次生物质，用来驱避植食性昆虫而保全自己，干扰昆虫的正常生长[6]。Zhang[7]用含0.5%和1%的槲皮素饲料喂食家蚕，用实时荧光定量PCR检测到中肠组织中CYP6AB5、CYP6B29基因表达量分别是对照组的10.9倍和6.2倍；同时用槲皮素和芦丁分别处理整蚕后细胞色素P450酶活性也显著上升。本人前期用芸香苷诱导家蚕，用双荧光定量PCR也检测到在中肠和脂肪体中CYP4M5和CYP4M9基因的转录上调。这些结果说明细胞色素P450基因与植物次生物质的代谢具有一定的相关性。

2 对氟化物的诱导表达

随着我国工业化的发展，大量氟化物被释放到环境中，随桑叶进入蚕体累积，与组织中的蛋白质结合，抑制组织细胞的生长发育，使蚕体出现氟中毒现象，甚至死亡[8，9]。氟化物污染对蚕业生产造成的危害和相关产业经济损失已引起蚕业界广泛关注。Zhou等[10]用荧光差异显示技术对家蚕抗性品系与敏感品系的中肠组织进行比较对照分析，结果在只存在于抗性品系中的一条特异性电泳条带克隆获得一个家蚕P450基因CYP306A1，实时荧光定量PCR结果分析表明该基因在抗性品系中具有较高转录活性。对该基因的表达特异性用半定量PCR分析，结果只在中肠和卵巢两个组织中表达。米智等[11]发现在氟化物诱导后家蚕抗性品系T6中肠组织中的细胞色素P450含量比对照组高3～7倍，而敏感品系734的变化则不明显。该酶系中细胞色素b5含量的变化与其基因表达具有较高的一致性，表明P450酶的活性也与之相关。米智[12]还发现在NaF作用下耐氟抗性品系T6中肠的NADPH一细胞色素P450还原酶CPR活性变化范围与对照组相差不大，而敏感品系734的活性变化范围比对照组显著上升，由此推测CPR与家蚕对氟化物代谢也具有一定的关系。本研究室Sisi Zhao[13]在NaF诱导后用双荧光载体检测系统检测到CYP9A19和CYP9A22基因启动子活性有明显的剂量效应。

3 对杀虫剂的诱导表达

人们对昆虫杀虫剂抗性研究一般是为了降低昆虫的抗性，但对家蚕而言则主要是为了提高对杀虫剂的抵抗力。

Yamamoto等[14]利用二嗪农、吡虫啉、苄氯菊酯等不同种类农药分别对家蚕进行添食，微阵列结果表明二嗪农与CYP4M5、CYP4G22(CYP4G25)和CYP333A2(BGIBMGA005356)、吡虫啉与CYP9A20，CYP4G22和CYP333A2，苄氯菊酯与CYP4G22和CYP333A2之间呈现出诱导表达上调的关系，其中CYP4G22可在吡虫啉、苄氯菊酯诱导下分别上调表达8.3倍和8.9倍。李涛[15]用溴虫腈药液浸泡桑叶喂食家蚕，发现同一龄期耐受品系的细胞色素P450含量高于敏感品系，而且耐受品系的幼虫随着发育龄期对溴虫腈的耐受性也增加。顾芝亚[16]用辛硫磷添食家蚕，用芯片技术和荧光定量PCR方法都检测到CYP4G25和CYP9A21基因在转录水平显著上调。Fanchi Li等[17]在辛硫磷诱导家蚕后用基因芯片技术发现细胞色素P450基因4家族、6家族、9家族基因在脂肪体中表达都上调，用实时荧光定量PCR技术检测到CYP49A1、CYP6AB4、CYP9A19、CYP9A22基因在诱导后持续高水平表达。赵国栋等[18]用微量氰戊菊酯添食家蚕，用荧光定量PCR方法检测到敏感性品系脂肪体组织中CYP9A19和CYP9A20基因的转录水平与对照组相比显著下调，在中肠组织中两个基因的转录水平变化不明显；而耐受品系的中肠组织中这两个基因的转录水平与对照组相比显著增加，在脂肪体组织中CYP9A20基因的转录水平也显著上调。这些结果说明家蚕细胞色素P450基因家族在杀虫剂代谢解毒中起一定的作用。

4 对纳米二氧化钛的诱导表达

纳米二氧化钛的粒径＜100nm，由于具有抗菌、自洁净、抗老化及较高的化学稳定性、热稳定性、超亲水性、非迁移性、表面吸附性和光催化活性等特性，被广泛应用于漂白、食品添加剂、遮光剂和化妆品等领域。低浓度的纳米二氧化钛对核酸的合成不会造成影响，但高浓度的纳米二氧化钛对生物则具有一定的毒性作用[19，20]。由于纳米二氧化钛具有一定的生物活性，已被农业部列入饲料添加剂品种目录[21]。占鹏飞等人[22]用低浓度纳米二氧化钛浸泡桑叶后喂食5龄起蚕，发现细胞色素P450氧化酶活性显著上升，用实时荧光定量PCR检测到BmCYP6ae22基因在不同组织中的转录水平有差异，在脂肪体中最多，是对照组的3.438倍，中肠次之，是对照组的2.24倍，与其酶活性的变化趋势一致。说明低浓度纳米二氧化钛可以诱导家蚕细胞色素P450基因表达上调，解毒酶活性上升，提高对进入体内有毒物质的降解能力。

5 总结与展望

昆虫在与植物的协同进化中，可以改变其取食策略或调节生长发育节律对植物的防御进行抵抗，同时又能降低靶标物对有毒物质的敏感性，增加解毒酶活性来主动降解植物产生的有毒物质进行反防御[23]。昆虫P450基因不仅能直接参与植物次生有毒物质的代谢降解，而且已有研究表明还可以通过窃听植物的分子信号来活化自身解毒酶活性[24]。唐涛等[25]通过RNA干扰技术发现转录因子AhR信号通路可能参与P450解毒酶基因的表达调控，而且通过遗传分析，棉铃虫转录因子AhR和ARNT基因与家蚕同源性最高，为进一步调控机制研究奠定分子基础。

鳞翅目有多种昆虫，是昆虫纲中第二大目，又是主要的农业与森林害虫，而家蚕作为重要的经济昆虫和实验动物，是第一个完成了全基因组测序的鳞翅目昆虫，其基因组中P450基因已经得到序列分析与功能的初步预测。而且研究发现家蚕84个P450基因中主要与代谢抗性相关的基因产生大量的串联复制，数量众多，且相互之间存在一定的底物相似性、重叠性，在功能上表现出一定程度的冗余，使其在应对外界抗性时具有较强的弹性[26]，因此，利用微阵列、荧光定量PCR、基因芯片及RNA干扰技术等基因组学研究技术对P450基因家族进行功能验证、参与反防御机制的深入研究，可以为害虫治理提供可靠的靶标位点，推动害虫治理向分子水平进步。