赖氨酸特异性去甲基化酶6A及其在白血病中的研究进展

申 婕，曾志辉，杨 雷，曾茂君，欧阳喆深，赵明一，杨明华

1中南大学湘雅三医院儿科，长沙 4100132广东省心血管病研究所 广东省人民医院心血管外科 广东省医学科学院，广州 5100803湖南师范大学医学院，长沙 4100004中南大学湘雅医院儿科，长沙 410008

白血病是起源于造血干/祖细胞的恶性克隆性肿瘤疾病，位居我国最常见的恶性肿瘤前10位，也是儿童的恶性肿瘤所致死亡的首位原因[1]。白血病细胞在骨髓或其他造血组织中大量增殖和积累，从而抑制正常的造血功能并渗透其他器官和组织，但其具体病因及发病机制尚未完全清楚。表观遗传学是指不改变DNA序列而发生的可遗传的基因表达的变化[2]。表观遗传修饰主要包括DNA甲基化、组蛋白的共价修饰、染色质重塑、非编码调节性RNA等，其中组蛋白修饰是近年的研究热点，主要包括甲基化、磷酸化、乙酰化和泛素化等。这些修饰可以影响组蛋白与DNA的亲和力从而改变染色质的状态，此外，还能调控转录因子与DNA的结合，最终影响靶基因表达。白血病的异质性是多层面、多组学的[3]。有趣的是，针对白血病患者的表观基因组高通量测序分析的研究揭示了表观遗传修饰在白血病发病机制中的重要作用[4]，包括DNA甲基化、甲基化胞嘧啶的氧化衍生，以及组蛋白翻译后修饰改变，如赖氨酸甲基化、磷酸化和乙酰化，动物实验显示靶向位点治疗药物研究卓见成效。因此，基于该领域的研究将为白血病的治疗带来崭新的契机。

组蛋白甲基化的调控与白血病

癌症的研究多集中在遗传学，近年对白血病的研究焦点开始逐渐转向表观遗传学，组蛋白甲基化/脱甲基化失衡是其中重要的一个环节。组蛋白甲基化发生在组蛋白H3和H4的N-末端赖氨酸和精氨酸残基上，是由组蛋白甲基转移酶和组蛋白去甲基化酶调节的动态可逆过程。组蛋白甲基化平衡在异染色质形成、X染色体失活、基因印记和转录调控中发挥重要作用，与组织发育、代谢平衡、免疫、肿瘤发生等过程密切相关[2，5-6]。一般而言，H3K9、H3K27、H3K72的甲基化与转录抑制有关，H3K4、H3K36、H3K79的甲基化与基因转录激活有关。目前已发现一些组蛋白甲基转移酶的表达异常与白血病密切相关，比如H3K79甲基转移酶Dot1样组蛋白H3甲基转移酶抑制组蛋白去乙酰化酶沉默信息调节因子1介导的表观遗传沉默，以维持混合谱系白血病(mixed-lineage leukemia，MLL)中的白血病基因表达[7]。

另一方面，针对组蛋白去甲基化酶对白血病的影响的研究也于近年取得喜人进展。 赖氨酸特异性去甲基化酶(lysine-specific demethylase，KDM)1A、 KDM2B、 含jumonji结构域的组蛋白去甲基化酶1C(jumonji domain containing 1C，JMJD1C)、 KDM4C、 植物同源结构域锌指蛋白8(plant homeodomain finger protein 8，PHF8)等组蛋白去甲基化酶被证实在白血病中有潜在致癌作用，而KDM3B起到抑癌作用[8]。KDM6A，又称X染色体上普遍转录的四肽重复序列(ubiquitously transcribed tetratricopeptide repeat on chromosome X，UTX)，可通过去除H3K27me2/3甲基团而激活靶基因的表达，在胚胎发育、组织特异性分化、癌症发生发展等过程中都发挥重要作用。本文聚焦于KDM6A(UTX)，并对其在白血病中的双重作用及潜在治疗可能性进行综述。

UTX的生物学特性

KDM6家族成员 KDM6家族成员包括UTX(KDM6A)、JMJD3(KDM6B)、UTY(KDM6C)，其共同点是都包含一个非常保守的JmjC结构域。人的UTX基因是在1998年寻找UTY的同源基因时发现的[9]，而2007年几个研究小组证实UTX和JMJD3是新的H3K27me2/3去甲基化酶[10-12]。人的UTX基因位于性染色体Xp11.2，编码由1424个氨基酸构成的UTX蛋白，其包含6个TPR(四聚肽重复序列)结构域和JmjC结构域[13]。JMJD3位于常染色体17p13.1，编码由1679个氨基酸构成的JMJD3蛋白，但其不包含除JmjC结构域以外的任何特征结构域[13]，其JmjC结构域与UTX的JmjC结构域有84%相似性(70%一致性)。UTY是UTX的Y连锁同源基因，位于Yq11，氨基酸序列比较分析显示，UTX和UTY序列的相似性在人类为88%、小鼠为82%。UTY蛋白同样包含TPR结构域和JmjC结构域，其中两者的JmjC结构域的相似性在人类为98%，在小鼠则为97%；TPR结构域相似性在94%[14]。

已经证实UTX和JMJD3的H3K27去甲基化酶功能依赖于JmjC结构域的催化活性，值得注意的是，同样包含JmjC结构域的UTY却在体外实验中未显示去甲基化酶功能[10]，但也有实验表明由于JmjC催化结构域的突变，UTY可表现出微弱的去甲基酶活性[15]。在基因敲除小鼠的实验模型中证实，UTY可部分补偿UTX的功能[16]。UTX和UTY的TPR结构域在蛋白-蛋白相互作用的过程中起到重要作用，即KDM6家族成员的作用并不仅仅依赖于去甲基化酶功能，其中涉及到的结构域及相关功能的阐明亟待进一步的研究。

UTX的去甲基化酶功能 H3K27甲基化与基因抑制有关，它是组织发育、干细胞分化和癌症发生发展过程中的关键性表观遗传事件。 H3K27的甲基化由Polycomb家族蛋白(PcG蛋白)中的PRC复合物催化，包括PRC1和PRC2。 PRC2首先与染色质结合并使H3K27三甲基化，然后H3K27me3被PRC1识别并最终导致染色质压缩和RNA聚合酶Ⅱ的暂停，从而发挥转录抑制功能。 JMJD3和UTX是唯一可以将H3K27me3去甲基化为H3K27me2或H3K27me1并解离PcG蛋白的两种蛋白[11]。越来越多的证据表明，控制H3K27甲基化酶活性的改变可导致癌症发生[17]。在多种癌症中(淋巴瘤[18]、膀胱癌[19]、胰腺导管腺癌[20]、乳腺癌[21]、前列腺癌[22]、结肠癌[23])，PcG蛋白通过对抑癌基因的调控发挥致癌作用。UTX可通过H3K27me3去甲基化逆转PcG蛋白介导的转录抑制，从而在不同的癌症中发挥重要作用[24]。

UTX蛋白定位于细胞核，其促进H3K27me3去甲基化发生，继而促进H3K27me2 去甲基化为H3K27me[24]。该去甲基化酶活性取决于JmjC结构域，其含有与辅助因子Fe(Ⅱ)和α-酮戊二酸结合的保守残基。Sengoku和Yokoyama[25]鉴定出UTX催化结构域的晶体结构，包括Jmj结构域(Jumonji结构域)和高度保守的C-末端区域，后者含有螺旋结构域和Zn结合结构域。其中Jmj和Zn结合域分别识别组蛋白H3的两个独立区段，从而实现H3K27的底物位点特异性。

UTX的非去甲基化酶功能 混合谱系白血病基因MLL首次被报道，是在血液恶性肿瘤患者看似随机易位导致的致癌融合基因中[26]。最早在酵母中鉴定出MLL的祖先同系物Set1，并发现其存在于大分子复合物COMPASS(complex of proteins associated with Set1)中[27]。目前研究表明，Trithorax 家族(TrxG)均含有1个SET结构域，TrxG需与其他亚基一起参与到COMPASS复合体中才能维持一定的H3K4甲基转移酶活性，从而激活靶基因的转录[28]。

不同的COMPASS 还包含有一些自身特有的亚基，Trr及MLL3/MLL4-COMPASS复合体中含有特有的UTX、PTIP、ASC-2和PA1。Issaeva等[29]的研究显示3个复合物成员MLL4、PTIP和UTX共定位于由转录激活标记H3K4me3标记的MLL4靶基因的启动子区和第一外显子区。在果蝇中，dUTX突变体组织表现出H3K27me3修饰水平的增加和H3K4me1修饰水平的降低，且UTX对增强子区域和转录活跃的基因体处富集的H3K4me1的影响似乎与其去甲基化能力无关[30]。微阵列测定研究筛选了敲低/上调UTX或MLL4后表达差异达到至少2倍的基因，其中54%的shUTX下调基因(656/1215)与73%的shMLL4下调基因(656/899)重叠，68%的shUTX上调基因(1065/1576)与77%的shMLL4上调基因(1065/1389)重叠，这些结果表明大多数MLL4参与了UTX对基因的共同调节[31]。

过去研究表明UTX可以参与形成H3K4甲基转移酶的复合物从而激活转录发挥功能。近年有课题组研究显示突变了mESC细胞系中的MLL3和MLL4甲基转移酶活性中心，使其无法催化增强子区域的H3K4me1，却发现增强子及靶基因活性几乎没有变化；而双敲除MLL3/4，基因转录活性则会显著下降，这表明MLL3/4-COMPASS复合体激活增强子的作用与其对H3K4me1的催化活性无关，而是充当转录共激活因子促进Pol Ⅱ在增强子和启动子上的加载。因此，MLL3/4-UTX复合物促进转录的具体生理功能需要进一步的研究[32]。

除了组蛋白修饰外，包括SWI/SNF家族在内的ATP酶依赖性重塑复合物有助于染色质重塑，从而实现转录激活和抑制[33]。SWI/SNF家族主要与转录激活相关，其中ATP酶复合物成员BRG1和BRM通过其含溴结构域与乙酰化组蛋白尾部相互作用[34]。而含有BRG1的SWI/SNF重塑复合物与组蛋白H3K27me2/3去甲基化酶UTX之间的相互作用证明UTX可以促进一般的染色质重塑，其不依赖于它的去甲基化酶活性[35]。

研究证实转录抑制标记H3K27me3的下调可伴随着转录激活标记 H3K27ac的上调[36]，H3K27ac主要在活跃转录基因的增强子、启动子和基因体中检测到，而组蛋白乙酰转移酶，即环磷酸腺苷反应元件结合蛋白的结合蛋白(CREB binding protein，CBP)是催化H3K27乙酰化的关键酶[37-38]。在哺乳动物和果蝇中观察到CBP和SWI/SNF复合物之间存在相互作用。有研究证实在果蝇中，UTX和SWI/SNF复合物中的BRM可以和CBP的锌指结构结合以实现高效的H3K27乙酰化，并在拮抗Polycomb沉默靶基因的过程中起重要作用[39]。此外，MLL3/4-COMPASS复合物还可以募集转录共激活因子p300催化组蛋白H3K27的乙酰化并激活增强子[40-41]。

综上，UTX可通过其去甲基化酶及非去甲基化酶功能共同调控靶基因转录的激活，其发挥去甲基化酶功效使得转录抑制性标记H3K27me2/3下调；作为COMPASS复合体的亚基调参与调控转录激活性标记H3K4me1、与SWI/SNF家族结合促使形成开放的染色质构象、促使转录激活性标记H3K27ac生成等。

UTX与白血病

UTX对造血系统发育的影响 UTX已被证明在细胞重编程、胚胎干细胞和胚胎发育、组织特异性分化包括心脏发育和造血等过程中发挥重要作用[17]。Liu等[42]研究显示UTX表达水平在造血干细胞和祖细胞中达到峰值，在造血分化期间下降；敲除UTX基因，会影响小鼠造血祖细胞系EML及骨髓细胞的集落形成能力；UTX表达下调也可严重抑制人白血病细胞的增殖及影响调节造血分化的关键基因的表达，如MLL1、Runx1和Scl。研究者进一步证明UTX直接与上述基因的启动子相关联，并通过控制各启动子区域上的H3K27me3标记调节它们的转录。UTX对iNKT细胞的发育也很关键，缺乏UTX使PLZF表达下调，导致CD4+CD8+双阳性胸腺细胞向iNKT细胞的发育受阻，并影响iNKT细胞亚群的分化；由于Tbx21、Cxcr3及I12rb转录减少，促使iNKT细胞发育停滞在Ⅰ和Ⅱ阶段[43]。

UTX对白血病的抑癌作用 表观遗传调控基因如BRG1、MLL4、ARID1a、UTX等基因的突变是重要发现之一，其中UTX在肿瘤中除发生点突变外，还能以非常高的比例完全缺失[44]。通过外显子和全基因组测序，在一些白血病和实体瘤中发现了显著的失活性UTX突变和缺失[45]，UTX在急性淋巴细胞白血病(acute lymphocytic leukemia，ALL)[46-47]、慢性骨髓单核细胞性白血病(chronic myelomonocytic leukemia，CMML)[48]、多发性骨髓瘤[49]等多种恶性血液系统疾病中发生突变。在CMML中，UTX和EZH2突变导致的功能丧失与表观遗传调节子基因ASXL1、TET2或CBL突变共同发生[48]。在正常核型AML的患者中证实，UTX突变的增加与晚期复发、化疗耐药相关，低UTX表达与不良临床预后密切相关[50]。UTX以往在白血病中被认为是一种肿瘤抑制因子[46，51]。

Ntziachristos等[46]通过RNA敲减等手段在急性T淋巴细胞白血病(T-cell acute lymphoblastic leukaemia，T-ALL)模型中发现UTX作为肿瘤抑制因子起作用，并且经常在T-ALL中遗传失活，UTX的沉默可使得白血病细胞增殖增强。UTX的敲除可使得肿瘤抑制基因，如视网膜母细胞瘤结合蛋白6(Rbbp6)，Notch1途径活性抑制剂Fbxw7和PRC2成员Suz12的表达下调，而在T-ALL中具有致癌作用的基因如JMJD3、IL2RA等上调。

Van der Meulen等[51]同样用T-ALL模型证明，UTX在这种Notch1过表达引起的疾病中具有男性特异性的抑癌作用和突变分布，提示T-ALL发病率的性别差异可能就是与UTX逃脱X染色体失活机制相关，且UTY不能补偿UTX的某些去甲基酶依赖性活性，此外，大多数UTX突变靶向蛋白的JmjC结构域，在T-ALL中，UTX突变与TLX3致癌基因的异常表达共同发生，激活了Notch1的突变表达以及针对PHF6的突变或缺失。Notch1和UTX驱动的肿瘤是异质性的，敲低或敲除UTX可导致小鼠模型中Notch1驱动的白血病的加速发展，以及H3K27me3在推定的肿瘤抑制基因的启动子上的积累，这与控制致癌基因的JMJD3相反。

Zheng等[52]的研究表明在小鼠中敲除UTX可导致CMML，表现为脾肿大、单核细胞增多和髓外造血。患者的突变数据分析提示UTX突变与髓样恶性肿瘤中的TP53突变同时发生，并且UTX和Trp53的组合失活以细胞自主方式加速CMML的发展。UTX缺失导致造血干细胞的自我更新增加，并使易感的造血干细胞分化成髓系。以上提示UTX通过控制造血干细胞的自我更新和分化抑制CMML的形成。

Gozdecka等[16]在AML模型中证实基因UTX的缺失会加速急性髓细胞白血病(acute myelogenous leukemia，AML)的发展，并首次确认了只存在雄性体内的白血病相关基因UTY，它可以保护缺乏UTX的雄性小鼠避免AML的发生，研究者使用CRISPR/Cas9技术实现UTX的表达缺失，发现UTX的纯合缺失可以诱导小鼠模型中自发性白血病的发生，且致使造血干细胞和祖细胞数量、功能和分化失调；而UTY能抑制白血病并逆转UTX缺失导致的白血病表型。基因组分析证实UTX的缺失通过改变增强子功能、激活致癌ETS转录程序在白血病中发挥作用。此外，研究者还发现UTX缺失影响BRG1-SMARCA4依赖性染色质重塑，从而抑制白血病发展期间起抑制肿瘤作用的GATA程序，并且使染色质可以接近其他转录因子从而促进AML进展中ETS因子作为“先导信号”的功能[16]。这就提出了UTX缺失导致AML的非去甲基化酶作用的新机制：UTX充当“支架”，聚集大量控制DNA和基因表达的调节蛋白，并且这种功能也可以由UTY补偿，当UTX/UTY缺失时，这些蛋白质功能失活，AML就更容易发生[16]。

UTX对白血病的促癌作用 UTX在癌症发病机制中的作用复杂，虽然大量实验证实其是肿瘤抑制因子，但是最近也有研究表明在T-ALL的不同亚型中UTX发挥不同的作用[53]。T-ALL的不同亚型起因于T细胞祖细胞中特定转录因子的异常表达，T-ALL中最常见的致癌转录因子之一是TAL1，其在40%～60%的T-ALL患者中异常表达。临床上，与不表达TAL1的其他亚型相比，TAL1阳性的T-ALL亚型预后极差。免疫共沉淀实验证明TAL1的bHLH结构域与UTX之间存在相互作用，这表明UTX可以作为T-ALL中TAL1介导的致癌程序的共同激活因子。为证实这一假设，研究者检测了UTX是否能结合TAL1相关的激活基因，包括RALDH2(也称为ALDH1A2)、原癌基因MYB以及参与细胞增殖(ERG)和凋亡抑制的基因(CD226)，染色质免疫共沉淀实验证实UTX与所有检测的TAL1靶基因结合。此外，这些基因的表达在UTX敲低后显著降低，伴随着H3K27me3水平的增加。最后，TAL1的敲低导致其靶基因座上结合的UTX显著降低，伴随着H3K27me3的增加和基因表达的减少。上述结果均表明TAL1介导的UTX募集通过主动去除抑制性组蛋白标记H3K27me3促进参与增殖和凋亡抑制的特定基因的表达。也就是说在TAL1阳性(但不是TAL1阴性)的急性T淋巴细胞白血病中，UTX被确定为白血病维持所必需的促癌辅助因子[53]。

UTX与白血病的治疗

H3K27m3去甲基化酶为包括肿瘤学在内的广泛治疗领域的治疗干预提供了潜在的新机会。研究者使用结构引导的小分子和化学蛋白质组学方法发现两种称为GSK-J1/4的抑制剂，其可抑制UTX和JMJD3的表达[54]。据报道，H3K27m3去甲基化酶的抑制剂可选择性抑制癌症发生。Benyoucef等[53]最近在体内使用可有效杀死TAL1阳性原发性人类白血病的GSK-J1，这提供了基于UTX抑制剂的白血病新型治疗方法。同时，GSK-J4还可作为ALL的癌症治疗药物[46]。此外，在表观蛋白小分子抑制剂文库中，经过筛选还发现溴结构域和末端基序蛋白家族的抑制剂，即JQ1对于UTX缺失肿瘤存在潜在的选择性杀伤活性[55]。在AML中的一项研究结果表明，毛喉素作为一种天然的腺苷酸环化酶激活剂，可通过环磷酸腺苷/蛋白激酶A介导的机制使人白血病U937细胞对GSKJ4抑制剂敏感，毛喉素通过诱导凋亡细胞显著增强GSKJ4诱导的抗增殖作用，伴随着显著的BCL2蛋白下调以及半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶3活化和多聚ADP核糖聚合酶蛋白质裂解，此研究结果提供了毛喉素/GSKJ4组合在白血病细胞中诱导的抗癌活性的初步证据，并强调了毛喉素和GSKJ4的联合应用在开发创新、有效的AML治疗方法中的潜力[56]。

基于GSK-J1及其异构体的结构反应性关系的信息限制，Hu等[57]初始化了基于GSK-J1结构的药物化学修饰，最终鉴定了几种表现出与GSK-J1相似活性的化合物。然而，所有这些抑制剂都只可以选择性地抑制一些或全部组蛋白去甲基化酶活性，却并未表现出特异性。值得注意的是，由于UTX和JDJM3在同一类癌症类型中可表现出完全相反的生理作用，因此，需要进一步探索能够分别特异性靶向UTX和JMJD3的抑制剂。

Van der Meulen等[51]在T-ALL中将UTX鉴定为真正的肿瘤抑制基因，研究者就假设UTX的缺失会使白血病细胞更容易受到特定染色质修饰药物的治疗。鉴于UTX的缺失与H3K27me3水平上调相关，研究者探索了EZH2的抑制剂3-去氮腺嘌呤(3-deazaneplanocin，DZNep)的作用，DZNep是一种特异性靶向减少H3K27me3标记的表观遗传化合物。DZNep处理癌细胞可导致癌细胞死亡率明显上调，正常细胞却不受影响。重要的是，研究者证实UTX的缺失增加了癌细胞对DZNep的敏感性，与对照组相比，用DZNep处理的UTX下调组，H3K27me3的表达显著降低，这为白血病治疗开辟了新的方向。含有EZH2突变体的TALL-1细胞系似乎对DZNep治疗具有耐药性，这需在临床水平上进一步验证。

UTX在白血病中的肿瘤抑制作用已得到很好的证明，这使得研究人员能够追求用于癌症治疗的新型UTX激活剂。据报道，组蛋白去乙酰化酶1从靶基因启动子解离后可将UTX募集至其靶基因启动子，导致H3K27三甲基化减少[58]。这项研究表明可以探索靶向激活UTX表达的上游信号传导途径的药物的可能性。遗憾的是，目前还未有任何UTX激活剂的研究报道。这可能归因于大多数分子靶向治疗是致癌基因抑制剂的事实。事实上，作用于失活的肿瘤抑制基因的药物似乎更难以发挥效能，然而在多种人类癌症的致癌过程中，抑癌基因的改变比致癌基因的改变更频繁。

UTX也可作为TAL1阳性急性T淋巴细胞白血病的致癌基因[53]。除了筛选用于癌症治疗的UTX抑制剂外，在癌细胞中消耗UTX蛋白是减弱其作用的最直接方式。目前的研究表明，通过小干扰RNA双链体减少UTX蛋白抑制了UTX在TAL1阳性急性T淋巴细胞白血病中的致癌作用，这为RNA干扰技术介导的治疗提供了基础。

展 望

综上，UTX通过去甲基酶依赖性和非依赖性功能充当基因表达的良好平衡剂，但肿瘤相关的UTX基因突变机制尚未完全阐明。目前研究确认UTX的功能是调控靶基因转录的激活，而根据下游靶基因的抑癌或促癌作用的不同，UTX在不同的肿瘤类型中发挥不同的作用。UTX在白血病中发挥双重作用的具体机制及涉及到的相关下游通路尚待研究。对UTX作为白血病抑癌/促癌基因的深入研究将有助于对白血病发生机制的阐明、诊断和治疗。此外，UTX作为转录因子的功能可能在疾病的发生上具有更加直接的作用，将其作为治疗靶点在药物的研发、个体化精准治疗方面具有重要的研究价值。