混合培养对益生菌和小球藻生长的影响

张元长，范明坤，谢仰杰,2

(1.集美大学水产学院，福建 厦门 361021；2.农业部东海海水健康养殖重点实验室，福建 厦门 361021)

0 引言

小球藻(Chlorella)属于绿藻门绿藻纲绿球藻目小球藻科，是海水鱼类工厂化人工育苗中常用的基础生物饵料，也是池塘水体重要的生物组分[1-2]。小球藻在鱼类育苗、养殖生产中，不但可以吸收水体中的氨氮等有害物质，同时也是轮虫等浮游动物的饵料[3-6]。在环境适宜时，小球藻能快速繁殖，而环境不适宜时，可能导致小球藻密度大幅度下降。小球藻密度过高或过低，均不利于水质和浮游动物数量的稳定，进而影响鱼苗的存活与生长。因此，采取措施保持育苗水体中小球藻密度的稳定，对于提高育苗成活率起着重要作用。

水产养殖生产上常用一些益生菌来调节水质，常见的有光合细菌、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)和乳酸菌(Lactobacillussp.)[7-9]。益生菌的使用，一方面可以降解氨氮、亚硝酸盐和硝酸盐，分解有机物质，同时也是轮虫等浮游动物的饵料。益生菌的使用必然对水体中单细胞藻类的繁殖产生影响。益生菌与单细胞藻类之间的相互影响如何，尚缺乏深入研究。为此，本研究选择生产上常用的光合细菌、枯草芽孢杆菌和乳酸菌，分别与小球藻混合进行培养，观察小球藻和益生菌的增长情况，分析益生菌与单细胞藻类之间的相互影响，为海产鱼类育苗水体的水质、饵料生物的调控提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

实验所用的小球藻为蛋白核小球藻(ChlorellapyrenoidosaChick)，培养条件为温度(25±1)℃、光照3000 lx、盐度25，采用经消毒的海水，添加营养盐(KNO350 mg/L，KH2PO45 mg/L，柠檬酸铁0.5 mg/L)后进行常规培养。取处于增殖期的藻液，计数后用消毒海水稀释到1.0×107cells/mL后用于实验。实验所用的光合细菌(photosynthetic bacteria,简称PSB)购自诺可信(厦门)生物科技有限公司，采用光合细菌培养基(厦门普得生物科技有限公司)，在温度(25±1)℃，光照3000 lx条件下进行扩大培养，计数后用消毒海水稀释到1.6×107cells/mL后用于实验。枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis) 和乳酸菌(Lactobacillussp.)均为广州市微元生物科技有限公司生产，实验前先将粉状菌用消毒过的海水进行溶解，密封后放在温度25℃的培养箱内培养1天，待菌从休眠期苏醒后取中间的悬液，计数后用消毒海水稀释到1.6×107cells/mL后用于实验。菌藻密度测定均采用血球计数板在显微镜下进行计数的方法。

1.2 方法

1.2.1 菌藻混合培养试验

菌藻混合培养实验设置小球藻+光合细菌(ZG)、小球藻+枯草芽孢杆菌(ZK)、小球藻+乳酸菌(ZR)3个实验组，并设置小球藻(Z)、光合细菌(G)、枯草芽孢杆菌(K)和乳酸菌(R)单独培养4个对照组(见表1)。每个实验组和对照组各设置3个平行，实验结果取其平均值。

表1 菌和小球藻的初始密度

说明：Z—小球藻组，G—光合细菌组，K—枯草芽孢杆菌组，R—乳酸菌组，ZG—小球藻+光合细菌组，ZK—小球藻+枯草芽孢杆菌组，ZR—小球藻+乳酸菌组

Notes:Z—C.pyrenoidosa，G—PSB，K—Bacillussubtilis，R—Lactobacillussp.，ZG—C.pyrenoidosa+PSB，ZK—C.pyrenoidosa+Bacillussubtilis，ZR—C.pyrenoidosa+Lactobacillussp.

参照养殖生产中的使用情况，设置各实验组和对照组的小球藻的初始密度为5.0×106cells/mL,菌的初始密度为8.0×106cells/mL(见表1)。采用小球藻原液、各菌原液和消毒海水进行配制，配制后添加营养盐(KNO350 mg/L，KH2PO45 mg/L，柠檬酸铁0.5 mg/L)。每组取100 mL溶液装入100 mL锥形瓶，置于光照培养箱培养，培养温度为(25±1)℃、光照为3000 lx，光暗比为12 h∶12 h。每天定时摇瓶2次，并随机调换位置。实验为期7 d。自接种起每日定时采样，用血球计数板在显微镜下进行计数以测定菌、藻的密度。

藻细胞和菌的日增长率(k)按公式k=(lnN2-lnN1)/(t2-t1)×100%计算，其中：k为增长率；t1、t2为培养时间(d)；N1、N2为培养t1、t2时的生物个数(cells/mL) 。

1.2.2 数据处理

实验结果用SPSS 20.0软件进行单因素方差分析，以P<0.05作为差异显著性水平。

2 结果

2.1 三种菌对小球藻生长的影响

各混合培养实验组和小球藻单一培养组的小球藻密度变化情况如图1所示。Z组(小球藻单一培养)的生长曲线呈缓慢递增趋势，在培养第7天时小球藻密度最高，为1.806×107cells/mL，平均日增长率为18.3%。ZY组(小球藻+枯草芽孢杆菌)和ZR组(小球藻+乳酸菌)分别在第4天和第5天时藻密度达到最大值，分别为1.703×107cells/mL和1.689×107cells/mL，两组之间无显著差异。在实验第1～5 天，ZY组和ZR组与小球藻单独培养的Z组间无显著差异，但在实验第6天和第7天，ZR组和ZY组的小球藻密度均呈现下降趋势，小球藻密度均显著低于Z组。ZG组(小球藻+光合细菌)从第1天开始小球藻的增殖速度都显著高于其他各组(见图1)，在第7天藻密度达到最大(4.134×107cells/mL)，平均日增长率为30.2%。

2.2 小球藻对芽孢杆菌增殖的影响

由图2可知，Y组和ZY组芽孢杆菌的生长曲线呈递增趋势，两组在培养第7天时芽孢杆菌的细胞密度分别为3.397×107cells/mL和3.667×107cells/mL，日增长率分别为20.7%和21.8%。两组增长趋势大致相同，统计分析结果表明，两组之间差异不显著(见图2)。

2.3 小球藻对光合细菌生长的影响

由图3可知，G组和ZG组光合细菌的生长曲线呈递增趋势，两组在培养第7天时光合细菌的细胞密度分别为2.522×107cells/mL和3.002×107cells/mL，平均日增长率分别为16.4%和18.9%。统计分析结果表明，两组之间差异不显著(见图3)。

2.4 小球藻对乳酸菌生长的影响

由图4可知，R组和ZR组乳酸细菌的生长曲线呈递增趋势，两组在培养第7天时乳酸菌的细胞密度分别为4.008×107cells/mL和4.593×107cells/mL，日增长率为23%和25%。统计分析结果表明，两组之间差异不显著(见图4)。

3 讨论

本实验结果说明，小球藻的初始密度为5.0×106cells/mL，菌的初始密度为8.0×106cells/mL，在温度(25±1)℃，光照3000 lx，光暗比12 h∶12 h的条件下，小球藻与光合细菌混合培养(ZG组)时小球藻的增殖速度最好，培养到第7天时藻密度达到4.134×107cells/mL，平均日增长率为30.2%(见图1)，显著高于小球藻单独培养的Z组，说明光合细菌能有效促进小球藻的生长，而与光合细菌单独培养的(G组)相比，光合细菌的密度变化没有显著差异，说明光合细菌的繁殖受小球藻的影响不显著。李小霞等[10]认为，光合细菌与小球藻混合形成了菌藻共生系统，该系统利用两者的协同作用达到两者自身生长的目的。光合细菌在分解有机物的过程中为自身代谢提供能量，也可以为小球藻提供无机盐。小球藻不仅吸收培养基的营养盐，还能将细菌代谢分解的物质吸收同化成自身物质，并通过光合作用释放氧气，进而为光合细菌提供充足的溶氧，以使其维持正常的生命代谢活动。光合细菌不仅能分解培养基中的有机物，还具有脱氮、固氮、产氢和同化一定浓度的硫化氢的作用，能净化水质，为小球藻的生长提供良好的环境[11]。陈小晨等[12]的研究表明，在营养浓度低时，小球藻与光合细菌混合会表现出促进生长的效果。

本实验结果表明，枯草芽孢杆菌和乳酸菌在前5天对小球藻的生长不产生显著影响，但在后期小球藻密度均出现下降趋势(见图1)。观察发现，Y组和ZY组在后期培养液变得混浊，底部有沉淀。这可能是由于后期溶氧不足，水质出现败坏，导致芽孢杆菌沉淀和藻类死亡。王月霞等[13]的研究表明，随着芽孢杆菌的大量繁殖，加快了水体的溶氧量的消耗，使小球藻产生的氧气不足以维持芽孢杆菌的有氧呼吸，大量的芽孢杆菌沉淀和小球藻死亡分解进而产生有害物质，破坏水质。此外，程新等[14]的研究结果显示，枯草芽孢杆菌产生的溶藻活性物质对小球藻的叶绿素a及藻体蛋白合成具有抑制效果。两种因素共同作用导致枯草芽孢杆菌与小球藻混合培养时，小球藻的增殖受到抑制。乳酸菌和小球藻混合培养的后期，观察到培养液变得透明，藻颜色减弱，pH偏酸性，这应该是因为乳酸菌分泌的乳酸降低了溶液的pH值[15],抑制了小球藻的增殖，甚至导致小球藻死亡。

本实验中实验组和对照组的有益菌都有增长增殖，但是增殖速度较缓。这可能是因为本研究重点考察益生菌对小球藻的影响，在实验所用的培养基中并未专门添加针对益生菌的营养液。在配制各组培养液时，必然会有益生菌所需的营养物质随着原液带入，使得益生菌能够继续增长，但由于营养成分含量的限制导致增殖速度慢。

小球藻是海水池塘育苗期间最重要的单细胞藻类，小球藻的稳定是取得较高育苗成活率的基础。从以上结果可知，光合细菌对于小球藻的繁殖具有促进作用，一旦池塘小球藻密度下降，在养殖管理中可以适当添加光合细菌来促进小球藻的生长。同时光合细菌也是轮虫的优质饵料。如果小球藻密度偏大，则可以使用芽孢杆菌和乳酸菌，这样可以适当抑制小球藻的繁殖，但在使用时，需要采取增氧措施以确保溶氧充足。