植物响应盐胁迫蛋白质组学研究进展

王 哲，柴里昂，樊怀福，2，杜长霞，2，*

(1.浙江农林大学 农业与食品科学学院，浙江 杭州 311300； 2.浙江农林大学 浙江省农产品品质改良技术研究重点实验室，浙江 杭州 311300)

土壤中的盐离子大量积累，植物根系周围的土壤渗透势降低，阻碍根系对营养物质和水分的吸收，降低营养物质的利用率和有效性，导致植物水分吸收和新陈代谢能力紊乱。日益严重的设施土壤次生盐渍化已成为制约我国农业生产以及设施农业可持续发展的主要非生物胁迫环境因素之一，对植物的危害主要有渗透胁迫和离子伤害[1]，其次还有氧化应激、离子不平衡或营养缺乏等[2]，严重影响了植物的光合作用、蛋白质和脂质代谢等生命过程。在长期演化进程中，植物形成了一系列如离子转运及区隔化、形成渗透调节物质及代谢物、提高抗氧化酶积累及活力、调节信号转导因子及盐胁迫相关基因的表达等防御机制来维持离子和渗透平衡[3]。植物体内大量存在的可溶性蛋白作为参与各种代谢与调节的酶，其含量变化是植物体在胁迫下(如盐胁迫)总代谢水平的一个重要参数[4]。蛋白质组学研究的核心技术是蛋白质的提取与分离，常用的技术有：双向电泳、荧光差异双向凝胶电泳、同位素亲和标签、同位素标记相对和绝对定量技术和蛋白芯片技术等。为监测植物蛋白质响应盐胁迫的动态变化，探索植物耐盐机理，丰富基因组信息资源，本文比较分析了甜土植物与盐生植物响应盐胁迫的表达情况，为作物抗盐品种改良和盐生植物作物化等提供参考。

1 不同植物类群盐胁迫响应蛋白质组学

依据植物对盐胁迫忍受能力或在盐渍生境的适应能力，将植物分为盐生植物和甜土植物。盐生植物是一类能在约200 mmol·L-1或更高的盐浓度环境中存活和繁殖的植物[5]，而在这种环境下不能正常生长和完成生活史的植物就是甜土植物。植物响应盐胁迫过程中，许多基因被激活表达或者表达受到抑制，导致参与响应盐胁迫的蛋白种类和数量大幅增加。因此，利用蛋白质组学技术挖掘各种植物在盐胁迫下的差异蛋白种类、数量及其变化规律，预测相关基因的种类、数量及其变化规律，为深入了解植物抗盐分子机制提供重要线索。

1.1 甜土植物

蛋白质组学技术为深入分析植物应对盐胁迫的代谢和调控机制提供了强有力的技术支撑，前人分析了黄瓜(Cucumissativus)[6]、玉米(Zeamays)[7]、拟南芥(Arabidopsisthaliana)[8-9]、水稻(Oryzasativa)[10-12]、紫花苜蓿(Medicagosativa)[13]、番茄(Lycopersiconesculentum)[14]、陆地棉(Gossypiumhirsutum)[15]、大豆(Glycinemax)[16]、大麦(Hordeumvulgare)[17]、葡萄(Vitisvinifera)[18-19]和豌豆(Pisumsativum)[20]等不同亚细胞结构、细胞、组织器官、个体响应盐胁迫差异蛋白变化的特征及规律。蛋白质组学分析表明，多数甜土植物盐胁迫应答蛋白质主要参与形态结构、碳和能量代谢、胁迫防御、核酸调控、激素合成、信号转导等过程。

1.1.1 形态结构相关蛋白

盐胁迫下，植物通过提高对逆境的适应能力来降低伤害程度，其结构形态必然发生变化。盐胁迫使植物的生殖发育进程提前，生长速率降低，植物叶面积减少，导致植物碳同化量的减少，进而抑制植物组织和器官的生长分化[21]。在研究葡萄不同组织应答盐胁迫中发现，根中有21种蛋白发生变化，而叶片和茎尖则分别有14和13种蛋白发生差异表达[18]，说明葡萄不同组织中的蛋白质组应答盐胁迫的表达有所不同，推测植物的不同组织感知盐胁迫时期不同，根部最先感知盐胁迫。盐胁迫能改变大豆一些胚轴和胚根部特殊蛋白的表达，晚期丰富蛋白、β-伴大豆球蛋白、碱性螺旋-环-螺旋蛋白等表达量上调，血凝素和31 ku糖蛋白前体蛋白等表达量下调，据此推测，这些蛋白质可能在大豆适应盐胁迫环境过程中发挥重要作用[16]。肌动蛋白纤维网络控制并维持真核细胞正常形态及内部构造，参与多种生理活动，且多种细胞因子均具备形成一种特定的新肌动蛋白纤维网络的能力。盐胁迫下水稻根肌动蛋白表达量上调[10]，但紫花苜蓿根中的肌动蛋白表达量却下调[13]，这表明不同植物的肌动蛋白在盐胁迫下表达具有复杂性，表达量的差异可能与不同植物的耐盐性有关。在逆境下野生西瓜(Citrulluslanatus)参与木质素生物合成的咖啡酰辅酶A-O-甲基转移酶和过氧化物酶活性增强[22]，表明木质素的增加可增强细胞壁的硬度，防止土壤中根的干枯。细胞骨架在生物和非生物等各种胁迫下迅速重塑得益于多种膜联蛋白[23]，β-微管蛋白等骨架蛋白表达量上调[24]，这也许是植物自身机制对盐胁迫的应答，在生物膜的构成、离子通道建立等方面具有重要作用。

1.1.2 碳和能量代谢相关蛋白

植物响应盐胁迫不仅仅表现在形态结构方面，在碳和能量代谢方面表现也很突出，碳和能量代谢的改变涉及糖酵解、三羧酸循环、电子传递链和ATP合成等高丰度酶的参与。在黄瓜[6]、番茄[14]根部观察到大量的糖酵解酶的存在，植物通过提高糖酵解酶的数量和活性来促进能量代谢，从而适应盐胁迫。同时拟南芥[8]、豌豆[20]中三羧酸循环途径能量代谢相关酶(α酮戊二酸脱羧酶、丙酮酸脱氢酶)表达量均上调，表明充足的能源是植物能够适应盐环境的主要条件之一。盐胁迫影响作物产量与胁迫条件下光合作用降低密切相关[25]，盐胁迫对光合作用的抑制是多方面的，既包括对CO2的吸收、运输及固定的影响，碳同化降低，也包括对光能的吸收、转运和电子传递的影响，还可能影响原初产物的利用、转运及分配。1，5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(Rubisco)是光合碳循环反应中重要的羧化酶，也是光呼吸途径必需的加氧酶，在光合作用暗反应中起着重要的作用[26]，增加Rubisco活化酶可大大提高Rubisco活性的固定量和利用率，对提高光合作用效率至关重要，紫花苜蓿叶片响应盐胁迫过程中光能的利用降低，可能是Rubisco表达下调导致的[13]。另外，植物中的光合碳固定蛋白酶、光系统Ⅱ复合体等在盐胁迫下发生差异表达，导致光合作用及作物产量下降[22]。拟南芥[9]在150 mmol·L-1NaCl处理后，叶绿素a/b结合蛋白、放氧复合体的33 ku和光系统Ⅰ捕光色素结合蛋白等这三种与光反应有关的膜蛋白表达明显上调，保证了植物在盐胁迫过程中存有足够能量，通过提高光合作用能力来提高其对盐胁迫的适应性。

1.1.3 信号转导相关蛋白

利用蛋白质组学技术检测到许多参与信号感知及转导的蛋白质，包括质膜受体或细胞质内受体、Ca2+信号传导蛋白等[27]，在盐胁迫下表达丰度发生显著变化。小G蛋白具有与G蛋白相似的功能，在细胞信号转导通路中起着分子开关的作用[28]，参与感受胞外刺激，且能通过不同的细胞内信号转导来响应这些刺激。高盐胁迫下水稻[12]中G蛋白、Rab5B、小GTP结合蛋白的表达量均上调，而水稻[11]中钙调蛋白、钙网蛋白与钙网蛋白前体、液泡钙结合蛋白相关蛋白表达下调，由此证明，不同植物或同一植物的不同器官响应盐胁迫时信号转导蛋白表达量不同，可能是因为耐盐性不同。信号级联调控不同的下游通路是植物抗逆性的关键，在玉米高盐胁迫过程中检测到与Ca2+相关的钙调蛋白和钙黏蛋白等信号蛋白，揭示了糖信号和细胞信号通路，并暗示了一个与NaCl诱导信号有关的转导链[7]。同时Colcombet等[29]对植物响应盐胁迫的信号转导途径进行了归纳，包括：盐过敏感信号转导途径、钙依赖型蛋白激酶级联反应途径、脱落酸信号通路、磷脂信号通路和促分裂原活化蛋白激酶级联途径等诱导信号转导途径。植物蛋白激酶通过ABA介导的信号通路来增强植株对盐的耐性，且通过独立于ABA的信号通路调控胞内能量状态，维持离子平衡[30]。磷脂信号通路和促分裂原活化蛋白激酶通过激活下游的酶、转录因子等应答因子将胞外的环境信号传递到细胞内，引起胞内转录及代谢水平的变化，进而调控细胞内胁迫应答反应[31]。在黄瓜[32]、大豆[33]等响应盐胁迫的过程中，MKK1和MAPK过表达会提高植株抗氧化酶的活性、增强植株的耐盐性，GMK1从胞质转移到细胞核中，激活转录因子来响应胁迫。据此推测，植物通过自身复杂信号转导系统的调控增强了对盐逆境的适应性及耐受性，这些途径在植物抗逆信号转导过程中起到枢纽作用。

1.1.4 胁迫防御相关蛋白

植物抗氧化系统相关蛋白是防御系统蛋白的一部分，在响应盐胁迫过程中发挥重要作用。在研究盐胁迫对黄瓜幼苗韧皮部渗出液超氧化物歧化酶，过氧化物酶和过氧化氢酶同工酶表达影响过程中，发现3种同工酶与其耐盐性均有密切关系，而且表达具有品种及组织特异性[34]。陆地棉幼苗根系在响应盐胁迫过程中，抗坏血酸氧化酶、谷胱甘肽转移酶的同源蛋白表达显著上调[15]。抗坏血酸氧化酶作为植物体中多铜氧化酶家族的主要成员之一，它能使抗坏血酸氧化成水和脱氢抗坏血酸，从而维持质体外氧化还原动态平衡；谷胱甘肽转移酶能催化亲核性的谷胱甘肽与亲电子外源化学物的结合反应，降低植物体内活性氧水平，从而达到解毒目的[35]。在不同耐盐型大麦蛋白质组响应盐胁迫研究中发现，耐盐性强的大麦根系中积累了较多与活性氧清除相关的蛋白[17]。在上述酶的保护下，植物细胞可以避免盐胁迫的氧化损伤。植物凝集素是一类具有特异糖结合活性的蛋白，可作为防御蛋白在植物响应盐胁迫中发挥作用[36]，是植物防御蛋白系统重要的组成部分，在植物保护上起着重要作用，且不同物种间利用凝集素应对胁迫的机制存在差异。盐胁迫下，水稻根中的甘露糖结合凝集素表达均上调[10]，但是大豆根中凝集素表达下调[16]。

1.1.5 植物激素合成和核酸调控相关蛋白

除此之外，植物激素合成和核酸调控类蛋白也受到了盐胁迫的影响。植物激素一定程度上能够缓解盐胁迫对植物的伤害，对植物生长发育有重要的调控作用，且在植株不同的生长阶段响应盐胁迫时表达量存在差异，如在植株营养生长和生殖生长阶段响应盐胁迫的表达量存在显著差异[37]。一些miRNAs在盐处理下表达下调，因此释放miRNA介导对ARF基因的抑制，并触发生长素信号，激活各种耐盐相关通路的下游成分[38]。植株感受到胁迫信号后，通过上调内源ABA的表达量，下调CTK和GA的表达量，诱导离子转运蛋白、抗氧化物酶及渗透调节物质合成相关蛋白等盐胁迫相关蛋白表达，植株表现出代谢减缓、生长抑制等现象，以增强植物的耐盐性[37]。因此，盐胁迫下植物通过各种激素间协作与平衡来调节自身内源激素水平，并不仅仅依赖某种激素含量的高低来适应环境。AGO(Argonaute)蛋白家族成员在小核糖核酸(RNA)介导转录后调控中有重要作用[39]，在病毒中也起着关键作用[40]。在拟南芥AGO家族基因的10种基因响应盐胁迫研究中，发现AGO2、AGO3和AGO7在盐胁迫下被诱导表达强烈，而且AGO家族基因存在显著的表达差异性[41]。盐胁迫下CsbZIP4转录因子在茶树叶片中表达上调2.9倍，而在根中表达显著被抑制，下调2倍，且CsbZIP4的过表达能够降低转基因株系种子萌发时对盐胁迫的敏感性，增强其抗性，说明CsbZIP4与茶树抵御盐胁迫密切相关[42]。

1.2 盐生植物

中国盐生植物种类为502种[43]，多种具有重要的经济、科研价值，是一类不可多得的重要经济植物。盐生植物有较强的抗盐优势，具有重要的研究价值。前人研究了红海榄(Rhizophorastylosa)[44]、星星草(Puccinelliatenuiflora)[45]、盐角草(Salicorniaeuropaea)[46]、海紫苑(Astertripolium)[47]、角碱蓬(Suaedacorniculate)[48]、獐毛(Aeluropuslittoralis)[49]、盐芥(Thellungiellasalsuginea)[24]、冰叶日中花(Mesembryanthemumcrystallinum)[50]和盐穗木(Halostachyscaspica)[51]等盐生植物对盐胁迫的响应，通过蛋白质组学技术发现差异蛋白主要涉及代谢和转导相关蛋白，其次是渗透调节和活性氧清除相关蛋白。

1.2.1 代谢和转导类蛋白

MutT/Pnudix类蛋白启动类异戊二烯在细胞内的生物合成途径，有助于保护自身免遭盐胁迫侵害和适应盐胁迫环境。盐胁迫下，红海榄[44]中MutT/Pnudix类蛋白表达显著上调，说明此类蛋白与盐胁迫相关。固定CO2关键酶——磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶活性随盐度升高而增强，表明盐分有利于红海榄向C4植物光合代谢途径转变，增强光合速率[52]，但红海榄的水分利用效率和最大光合速率均随盐度升高而降低，说明高盐胁迫下盐生植物光合作用也会受到抑制。且不同栽培方式下，响应盐胁迫的差异蛋白不同，盐水栽培下，上调表达蛋白与胁迫防御相关，淡水栽培下，上调表达蛋白与能量代谢相关。在不同盐胁迫下，星星草[45]、角碱蓬[48]、冰叶日中花[50]应答盐胁迫的差异蛋白表达量不同。黄烷酮-3-羟化酶、富含甘氨酸RNA结合蛋白、细胞色素P450、真核翻译起始因子蛋白eIF5A在NaHCO3胁迫下，表达量均显著高于NaCl胁迫，这些蛋白主要涉及碳水化合物代谢、氨基酸代谢和能量代谢等过程。植物可能通过增强蛋白质合成及降解能力、提高脯氨酸含量等途径来提高抗盐能力。獐毛嫩枝响应盐胁迫的差异蛋白量随着NaCl浓度的升高而增加，主要参与碳水化合物的合成、能量和蛋白质代谢、光合作用和信号转导等过程[49]。而在盐胁迫下杜氏藻(Dunaliellabardawil)[53]细胞的蛋白质组学研究中，共发现54种差异蛋白质，涉及蛋白质和膜的结构稳定与信号转导途径。

1.2.2 渗透调节和活性氧清除相关蛋白

不同盐胁迫下盐穗木的共同差异表达蛋白主要表现在细胞过程、代谢过程和信号转导等类别中，上调表达蛋白主要涉及渗透调节(海藻糖-6-磷酸磷酸酯酶D、磷酸乙醇胺N-甲基转移酶)和活性氧清除的相关蛋白(硫氧还蛋白、谷胱甘肽S-转移酶)，说明盐穗木能够通过促进渗透调节和增强活性氧清除来提高短期盐胁迫适应能力[51]。盐生植物固有的耐盐能力使其成为了解盐生植物对高盐度适应机制的模型。盐刺激后信号传递和激活能力是盐生植物在盐水环境中生存的关键。高盐度胁迫还能诱导植物激素的合成，特别是ABA[54]和特定基因表达和代谢产物合成的调控。ROS在应激下产生，参与涉及Ca2+信号传导、磷脂信号、MAPK活化以及脱落酸等转导过程[55]。因此，盐生植物蛋白质组研究促进了我们对其在高盐度条件下适应性的理解，包括通过盐腺分泌盐、调节细胞离子稳态和渗透压、活性氧的解毒以及膜组成的改变；通过改变光合作用与能量代谢模式提供更多能量来维持相对正常的代谢水平，并增强酶和蛋白质活性，维持植物体内离子平衡，从而实现更有效的ROS解毒和离子分离转运，从而提高抗盐能力。

2 甜土植物与盐生植物盐胁迫响应蛋白质组学的异同

甜土植物和盐生植物在响应盐胁迫时差异蛋白质数量及种类方面有显著差异，在机制和防御途径上有相似点。

相同点：①甜土植物和盐生植物响应盐胁迫的差异蛋白主要参与碳和能量代谢(丙酮酸磷酸双激酶)、胁迫抗性(类钙调磷酸酶亚基B蛋白质)、维持细胞或亚细胞形态结构稳定(β-微管蛋白)、信息传递(钙依赖蛋白激酶)等过程，在功能和目的上相似。②盐生植物和甜土植物都是通过在细胞内积累有机溶质(脯氨酸、可溶性蛋白和可溶性糖等)而获得渗透调节作用，维持和保护细胞及生物活性物质的功能正常运行，保持其组织的多种代谢物质(脂类、蛋白质、碳水化合物和核酸等)不受破坏的作用。

差异点：①盐生植物具有通过进化获得的独特的盐胁迫应答模式。表达模式不同的蛋白如Rubisco及其相关蛋白质、S-腺苷甲硫氨酸合成酶和超氧化物歧化酶，主要参与光合作用、形态结构、能量代谢及胁迫防御信号转导等过程，表明盐生植物可能部分含有与甜土植物相同或相似的抗逆基因或蛋白质。但在胁迫应答过程中这些蛋白质的表达模式存在差异，从而使得盐生植物具有更强的适应和抵御盐胁迫的能力。②盐生植物盐胁迫应答过程中具有特异的蛋白质表达：包括光合作用相关蛋白(低CO2诱导蛋白)、碳和能量代谢相关酶(NADPH脱氢酶)、核酸代谢相关酶(焦磷酸磷酸水解酶)、胁迫防御相关蛋白(过氧化物酶体发生因子)、转运蛋白(铵转运蛋白)等。③盐生植物独特的运输方式：通过细胞内的隔离将有毒害的离子经主动运输方式在不接触细胞质的情况下运输到液泡中，再通过囊泡将积累的盐离子排出，同时质膜Na+/H+逆向转运蛋白(SOS1)和液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白(NHX1)表达丰度显著上调，使Na+在盐腺积累后向液泡区域化，促进盐腺对Na+的分泌[56]，增强盐生植物耐盐性，还可以通过有效调控离子转运、ROS清除和渗透物质合成等相关蛋白表达来适应盐胁迫。④响应盐胁迫时调节范围不同：盐生植物通过全面调节光合作用、蛋白质的合成、物质运输、信号转导、细胞骨架重塑、离子转运和区隔化、渗透平衡、胁迫防御等相关蛋白表达量来获得相对较高的抗耐盐能力[57]，而甜土植物是部分或局部调节。

3 问题与展望

应用蛋白质组学技术可以筛选出由盐胁迫导致的植物体内差异蛋白质，通过解析其生物学功能，明确植物响应盐胁迫的调控机制。蛋白质组学方法为揭示植物在盐胁迫下特异蛋白质表达提供了线索，但是也有不足：①利用蛋白质组学筛选出响应盐胁迫的差异蛋白质后，后续研究欠缺。②同一作物响应不同盐类胁迫的调控机制有相同亦有不同之处，目前研究盐胁迫的盐类大多是NaCl，比较单一。③研究对象均为常见植物，种类有限，盐生植物的种类研究力度不够。

不同植物或同一植物的不同品种对同种盐的耐盐性会有所不同，产生不同的差异蛋白质，而这些差异蛋白质的正常表达往往是受某些基因的调控。因此，我们要利用蛋白质组学技术快速挖掘出盐胁迫应答的差异蛋白质，获得控制这些蛋白质的基因后，采用转基因技术培育耐盐性强的植物新品种。盐生植物具有较强的耐盐、抗盐能力，应加强对盐生植物适应抗盐生理机制的研究分析，挖掘盐生植物的经济价值，促进盐生植物作物化，找到提高甜土植物特别是设施栽培植物耐盐能力的新途径。