RNA干扰在破骨细胞分子调控应用的研究进展

2019-01-06张誉泓戚孟春董伟张明洋

中国骨质疏松杂志 2019年6期

张誉泓戚孟春* 董伟张明洋

1．华北理工大学博创口腔医院，河北唐山063000

2．华北理工大学附属医学院，河北唐山063000

RNA干扰(RNA interference，RNAi)现象最早是在1990年Jorgensen研究加深矮牵牛花花色的实验中发现的，该研究在大量引入同源编码基因后出现了白色的花朵，这种现象被称作共抑制现象［1］。随后，Fire等在研究秀丽新小杆线虫中发现，在给予线虫注射双链RNA后出现的基因沉默现象比注射单链正义或反义RNA更有效，并将此现象首次命名为RNAi［2］。破骨细胞介导的骨吸收是近些年的研究热点，本文总结了在破骨细胞分子调控中采用RNAi技术的应用，以期为科研工作者采用RNAi技术对破骨细胞的研究提供一定的参考。

1 RNAi的作用机制及优缺点

作用机制:RNAi的过程包括起始阶段、效应阶段和扩增阶段［3］;在RNA干扰过程中有两种作用的分子，分别是小分子干扰 RNA(small interfering RNA，siRNA)和微小 RNA(microRNA，miRNA)。①起始阶段:双链RNA(dsRNA)经由细胞内具有核糖核酸酶Ⅲ活性的Drosha蛋白和Dicer酶识别内源或/和外源性dsRNA，并将其切割成为21～25个核苷酸的 siRNA或 miRNA。②效应阶段:siRNA/miRNA通过运载蛋白-5以及TRBP蛋白的作用下与具有裂解dsRNA活性的Argonaute2(AGO2)蛋白结合，组成RNA诱导沉默复合物，诱导基因沉默。具体是在解旋酶的作用下siRNA解螺旋，其反义链与靶基因mRNA通过碱基互补的方式结合，并活化RNA诱导沉默复合物，最终将靶基因mRNA剪切为碎片［4］。③扩增阶段:siRNA作为引物，靶基因mRNA作为模板，在RNA依赖的RNA聚合酶的作用下形成新的dsRNA，然后再重复经过起始阶段及效应阶段，如此循环往复产生级联扩增效应，加强靶基因的沉默效应。

RNAi具备以下优点:高特异性、内在生物学反应［5］和高效性，因此可作为多种类型细胞信号研究的筛选与验证工具。RNAi应用的主要问题是能否特异性地递送到靶向组织中，并长时间有效。病毒和非病毒载体可用以解决细胞转染效率低下的问题，非病毒传递在靶向、转染和表达方面效率极低，但是病毒载体存在如安全问题、病毒毒性高、可能致癌、已证实的免疫原性和成本限制等问题［6-7］。

2 RNAi在破骨细胞的有效靶点

破骨细胞由核因子 B配体激活受体(RANKL)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)刺激分化产生。破骨细胞的分化吸收又受到相关基因的调节，RANKL-RANK-OPG是诱导破骨细胞分化的重要途径，Ca2+/Calmodulin/NFATc1是破骨细胞生成的重要信号通路，骨质的降解依赖于骨吸收微环境的酸化以及破骨细胞分泌的各种酶类。

2.1 RANKL/RANK/OPG系统

RANK作为RANKL/RANK/OPG系统和RANK信号通路的汇聚点，在破骨细胞分化中起着主要作用，RNAi沉默RANK可以明显抑制小鼠骨髓来源的巨噬细胞向破骨细胞分化及活化［8］。体外选择性敲除小鼠骨髓细胞RANK基因能显著阻断酒石酸耐酸性磷酸酶的形成［9］。这些增进了科研者对于开发靶向RANK药物的热情。

2.2 Ca2+/Calmodulin/NFATc1信号通路

近年来研究发现Ca2+/Calmodulin/NFATc1是破骨细胞生成的重要信号通路，对OC分化及骨吸收发挥着极其重要的调控作用［10-12］。在 Calmodulin下游，CaMKs是calcineurin之外的另一类信号分子，在钙信号传递中负责下游许多信号蛋白的活化(磷酸化)，对OC分化及许多特异基因的表达起关键调控作用。通过RNAi敲除CaMK抑制了破骨细胞的生成［13］，CaMKs 包括 CaMKI、CaMKII、CaMKIV 3 种亚型，对 OC分化起作用的主要是 CaMKII和CaMKIV［14］;CaMKIV基因敲除可使OC生成数目显著下降［15］，国内学者对 CaMKIIγ、CaMKIIδ 进行RNA干扰可显著抑制破骨细胞生成及骨吸收功能［16-17］;NFATC1是破骨细胞生成的主要调节因子，被认为在破骨细胞形成中起着重要作用。小鼠单核巨噬细胞白血病细胞(RAW264.7)中采用RNAi特异性敲除NFATc1导致成熟破骨细胞的形成减少，并且明显降低破骨细胞特异性基因TRAP和组织蛋白酶K的表达［18］，这些研究结果表明RNAi对于破骨细胞的基因敲除发挥一定的作用。

2.3 骨吸收微环境的酸化

微环境发生酸化是启动酶降解骨基质的前提，骨吸收陷凹内的低pH(4～6)环境是由V-ATP酶质子泵形成的，可以通过抑制V-ATP酶等方法来阻止褶皱缘外的微环境pH的降低来降低破骨细胞的溶骨能力。Ac45(Atp6ap1)是V-ATP酶复合物的组成成分，负责酸化和内吞作用。Ac45基因对于破骨细胞维持正常的骨吸收功能是必需的。体外和体内RNAi敲除Ac45基因后，明显破坏了破骨细胞介导的细胞外酸化及骨吸收［19］。RNAi介导的Atp6i沉默阻止小鼠骨性根尖周炎的骨侵蚀与牙髓病炎症反应［20］，靶向Atp6i防止炎症和牙周炎引起的骨侵蚀并揭示其在骨免疫中的重要作用［21］，上述研究均揭示了使用RNAi技术靶向抑制AC45影响破骨细胞骨吸收的良好效果。

2.4 破骨细胞分泌的组织蛋白酶K及DC-STAMP蛋白

细胞分泌多种溶酶体酶，破骨细胞动员骨矿物质之后，几种水解酶会降解有机骨组分。参与该过程的主要蛋白酶是组织蛋白酶K(Cathepsin K)，并且Cathepsin K是破骨细胞的主要标志物，RNAi靶向Cathepsin K破坏破骨细胞在体内发挥骨吸收功能，并且可以减少88%的细菌感染刺激的骨吸收［22］。可见RNAi的立杆见影的影响。

树突状细胞-特异性跨膜蛋白(DC-STAMP)是介导人类无骨吸收能力的单核破骨细胞前体融合为具有骨吸收能力的多核破骨细胞所必需的关键性蛋白质。慢病毒其所介导的RNA干扰技术成功抑制了DC-STAMP表达，抑制了破骨细胞的生成［23-24］。

总之，RNAi在破骨细胞分子调控的应用越来越受到重视，这有可能成为未来破骨细胞分子水平研究的主要科研工具。