RNA m6A甲基化修饰的研究进展

茹文秀， 沈雪梅， 张晓燕， 陈 宏

(西北农林科技大学动物科技学院，陕西 杨凌 712100)

RNA在遗传信息传递过程中是连接DNA到蛋白质的一个关键，但合成的蛋白水平不一定和mRNA的水平正相关，这提示了RNA转录后修饰的重要性。到目前为止已经鉴定出来了100多种不同的RNA转录后修饰方式，其中最常见的RNA修饰方式是N6-甲基腺嘌呤(m6A)[1]。m6A是一种可逆的动态RNA修饰，可能会影响生物学调控，类似于DNA的甲基化和蛋白质的磷酸化，mRNA中的腺苷甲基化代表了一个额外的调控层，可以潜在地改变mRNA功能和影响基因表达[2]。

1 m6A的发现

20世纪70年代，一些研究小组发现哺乳动物细胞中的聚腺苷酸RNA含有丰富的m6A化学修饰[3]。然而由于当时缺乏研究m6A修饰的相关技术，导致数10年来m6A研究领域并没有什么进展，这使人们怀疑m6A是否是mRNA中普遍存在的修饰，以及这种修饰是否在生物学过程中发挥了重要作用[4]。2012年，两组研究人员首次在mRNA转录本上鉴定出了发生m6A修饰的位点，他们应用的方法称为MeRIP-Seq或m6A-seq，依赖于高度特异性的m6A抗体来免疫沉淀甲基化mRNA，然后通过高通量测序来确定甲基化的转录本。他们在人类和小鼠的细胞中检测到了超过7 000 mRNA转录本和上百个长链非编码RNA(lncRNAs)中具有m6A峰。同时这些m6A峰在人类和小鼠中是保守的[5-6]。研究者们发现，在哺乳动物mRNA中m6A修饰发生在在5′UTRs，终止密码子附近以及临近终止密码子的3′UTRs。m6A修饰在转录组中分布不均匀，它们优先富集在临近终止密码子的3′UTRs附近，再是CDS区和5′UTR[7]。利用motif算法对MeRIP-Seq数据进行生物信息学分析，确定了m6A发生的共同motifs：(G/A)(m6A)C。几乎90%的m6A峰包含了这些motifs[5-6]。目前已经在许多真核生物中发现了m6A修饰，从酵母、拟南芥、果蝇到哺乳动物，甚至在病毒中也存在m6A修饰[8-9]。在哺乳动物中，m6A广泛存在于多个组织中，其中在肝脏、肾脏和大脑中m6A修饰水平最高[6]。可见，m6A修饰存在普遍性，同时也有组织偏好性。

2 m6A酶系统

2.1 m6A甲基转移酶

m6A修饰主要由甲基转移酶复合体催化形成的，被称为“writers”。它是由2个亚基复合体：m6A-METTL复合体(MAC)和m6A-METTL关联复合体(MACOM)组成[10]。m6A-METTL复合体包括甲基转移酶3(METTL3)与甲基转移酶14(METTL14)，它们可以形成稳定的异二聚体，前者作为催化亚基是第一个被发现的甲基转移酶[11]，后者可以促进与RNA的结合[12-13]，它们是m6A修饰所必需的[14]。研究发现METTL3和METTL14之间的物理联系具有协同作用，METTL14可以使METTL3甲基转移酶的活性更高[15]。

进一步研究发现了m6A-METTL关联复合体，并揭示了它们如何促进甲基转移酶复合体的作用和特异性。Wilms肿瘤1相关蛋白(WTAP)有助于协调METTL3-METTL14异二聚体在核斑中的定位，从而促进m6A沉积[16]。m6A甲基转移酶相关的病毒(VIRMA)对m6A特异性地沉积到3′UTR是至关重要的[17]。CCCH型13锌指蛋白(ZC3H13)可以促进复合体的核定位[18]。RNA结合蛋白15/15B(RBM15/15B)可以结合富含U的区域并可能促进特定RNA的甲基化[19]。通过对甲硫氨酸腺苷转移酶(MAT2A)基因中SAM调控内含子保留的研究时发现，METTL16可以催化U6和MAT2A mRNA中的U6样发夹形成m6A修饰[20]。

2.2 m6A去甲基酶

m6A甲基化是个动态可逆的过程，它可以由去甲基化酶FTO或ALKBH5来逆转。它们都属于AlkB家族，以Fe(II)-和a-酮戊二酸酯依赖的方式催化m6A去甲基化，被称为m6A“erasers”[7,21]。2011年，首次发现FTO可以有效地去除体外和细胞内mRNA的m6A甲基修饰[22]。随后的研究表明，FTO可以将m6A氧化成两种之前未知的中间体——N6-羟甲基腺苷(hm6A)和N6-甲酰腺苷(f6A)[23]。最近的一项研究表明，FTO不仅可以去除m6A甲基修饰，还可以将细胞内m6Am去甲基化，而且催化活性更高[24]。m6Am可以稳定mRNA的帽子结构，因此，FTO同样是m6Am的橡皮擦，这个角色对mRNA的稳定性有影响[25]。在FTO被发现后不久，ALKBH5被鉴定为第二种哺乳动物m6A去甲基酶。与FTO不同的是，ALKBH5直接将m6A逆转为腺苷，从而检测不到任何中间产物[26]。

2.3 m6A结合蛋白

虽然RNA的m6A修饰是由甲基转移酶和去甲基化酶参与的一种动态可逆的方式塑造的，但优先识别m6A修饰的蛋白质(m6A readers)可以与甲基化的RNA结合并赋予其特定的功能[7]。

研究表明，YTH结构域可以选择性地结合RNA中的m6A位点，并赋予YTH结构域蛋白特定的功能[27]。可以识别m6A修饰并含有YTH结构域的蛋白有：YTHDC1、YTHDC2、YTHDF1、YTHDF2和YTHDF3。研究发现，与YTHDF2结合导致mRNA定位到衰变位点，如定位到处理体(p-body)加速降解[28]。相比之下，YTHDF1和YTHDF3在HeLa细胞中可以通过招募翻译起始因子来促进翻译[29-30]。YTHDC1具有多种调控作用，包括通过募集特定的剪接因子来调节mRNA剪接[31]，加速mRNA输出[32]，促进特定转录本的衰变[33]。最近的研究表明，YTHDC2通过其解旋酶作用可以提高HIF1α mRNA的翻译效率[34]，并可以调节精子的发生[35]。

Meyer等报道了真核起始因子3(eIF3)，它是43S翻译起始复合物的一个组成部分，可以直接与发生m6A的mRNA 5′UTR结合，这对翻译起始起着重要作用[36]。HNRNPC是一种丰富的核RNA结合蛋白，已知参与pre-mRNA的加工[37-38]，研究发现m6A可以调控HNRNPC-RNA的结合从而影响了靶基因的丰度和选择性剪接[39]。对哺乳动物细胞内mRNA的结构分析显示，mRNA的甲基化区域往往缺乏二级结构，这突出了m6A在改变RNA结构中的潜在作用[40-41]。HNRNP家族另一成员HNRNPA2B1最初被鉴定为m6A结合蛋白可以影响microRNA的形成[42]。另外一类readers，胰岛素样生长因2结合蛋白1-3(IGF2BP1-3)以依赖于m6A的方式稳定靶mRNA[43]。最近的一项研究证实了Prrc2a是一种m6A readers，结果显示重组Prrc2a可以稳定髓鞘形成所需的m6A-修饰的转录产物[44]。

3 m6A的生物学功能

最近的研究表明mRNA中存在的m6A修饰在基因表达调控[45]，动物发育[46]和人类疾病[47]中起着重要作用。

3.1 基因表达调控

m6A甲基化修饰通过影响mRNA的剪接、翻译、降解、定位对基因表达起着重要调控作用。METTL3、METTL14、WTAP和ALKBH5主要定位在核斑中，部分FTO也定位在核斑，众所周知核斑是pre-mRNA的处理场所[48]。敲除WTAP或METTL3确实会产生不同的mRNA剪切体，并且WTAP是已知的剪接因子[16,49]。此外，ALKBH5也被证明会影响剪接速率[50]。最近的研究发现m6A修饰可以通过改变mRNA的局部结构来影响与HNRNPC的结合，HNRNPC已证明参与pre-mRNA的加工[39]。在3T3-L1前体脂肪细胞中敲除FTO的研究报道了m6A在mRNA剪接中的调控作用。研究人员发现，FTO缺失后导致m6A水平升高，提高了RNA结合调控蛋白SRSF2的剪接能力，导致靶外显子的数量增加[51]。这些研究为m6A调控mRNA剪接事件提供了强有力的证据。

由于mRNA是蛋白质合成的模板，外显子和终止密码子附近存在的m6A使得RNA甲基化调控翻译成为可能。在酵母和人类细胞中检测mRNA中的m6A分布时发现核糖体相关组分明显富集。相反，在无m6A修饰的mRNA中并未发现核糖体相关组分的存在[52]。另一方面，对m6A“阅读器”YTHDF1的功能研究表明，它通过与起始因子和核糖体亚基的直接相互作用，提高了m6A修饰的mRNA的翻译效率[29]。值得注意的是，最近在小鼠胚胎干细胞(ESCs)的研究中发现通过核糖体质谱分析野生型和Mettl3 敲除的ESCs的翻译效率发现，在甲基化转录本上，敲除细胞的翻译效率有显著的提高[53]。

m6A介导的RNA在细胞质中降解的一个重要机制是利用“阅读器”。对RNA半衰期的研究发现，与对照相比YTHDF2敲除细胞的稳定性有显著提高。这种影响与YTHDF2的结合密切相关，结合越多的YTHDF2 RNA稳定性越差。重要的是，YTHDF2定位在细胞处理器 (P-body)上[28]。另一项研究发现，YTHDF2结合RNA上的m6A修饰，并通过与CNOT1的直接相互作用招募CCR4-NOT脱腺苷酸化酶复合体，加速RNA的脱腺苷酸化与降解[54]。另一种参与RNA降解的m6A“阅读器”是YTHDC2，研究发现在YTHDC2敲除的睾丸中m6A修饰的转录本上调[35]。不同于“阅读器”，m6A调控RNA稳定性的另一种方式可能是通过影响其二级结构。RNA结合蛋白HuR，它可以与mRNA 3′-UTR中的U富集区域结合，可以阻断miRNA结合Ago复合物，从而防止降解[55]。研究表明，由miRNA调控的靶基因，并且该转录本上存在m6A修饰，则HuR的结合受损，从而促进了mRNA的降解。同时，Mettl3的敲除导致Ago2与目标mRNA结合受到抑制，从而提高了其稳定性[28]。

寨卡病毒和HIV-1都存在高的m6A甲基化修饰，它们利用这种修饰在复制过程中增强了核输出和其他加工步骤[56]。在未受感染的人类细胞中，m6A结合蛋白YTHDC1介导了甲基化mRNA从细胞核向细胞质的运输。YTHDC1可以与SRSF3相互作用，SRSF3也可以与核输出受体NXF1相互作用。抑制YTHDC1并不会影响mRNA中m6A的整体水平，但会导致mRNA在核中的积累[32]。

3.2 动物发育

越来越多的研究表明，m6A修饰对生物早期的胚胎发育至关重要。在果蝇中，m6A甲基化修饰对性别决定和神经元功能是至关重的[57]。同时METTL3同源蛋白Ime4的敲除对胚胎发育具有亚致死作用，由于NOTCH信号通路受损，成年个体生育能力下降[58]。同样在拟南芥中，METTL3同源蛋白MTA缺失会影响其发育[59]。在酵母中，Ime4基因在酵母的减数分裂过程中发挥着重要作用[60]。在斑马鱼早期胚胎发育过程中母本向合子过渡时(MZT)，母源转录本被快速降解，胚胎的基因组会被激活。研究发现，部分母源mRNA被m6A甲基化，并被YTHDF2快速清除。敲除YTHDF2后，母源mRNA半衰期延长，阻止了卵子向受精卵的转变，胚胎无法及时启动MZT，导致子代斑马鱼的发育延迟[61]。这些研究表明m6A甲基化修饰在动物早期胚胎发育中具有重要作用。

最近的研究表明，m6A修饰参与了机体重要生命过程，如干细胞自我更新分化、脂类代谢、DNA损伤修复、热休克反应的控制，昼夜节律的控制等均有紧密的联系。在小鼠模型中，YTHDF1缺陷会损害海马依赖型神经功能，如空间学习和记忆等，但在海马体中过表达YTHDF1蛋白可以恢复这种损伤。在分子水平上，m6A修饰的转录本和YTHDF1结合促进了突触传递和长时程增强基因的功能[62]。在机体发生热休克后，METTL3定位于热休克基因染色质中，并使热休克基因发生m6A甲基化修饰，核YTHDF2将与去甲基化酶FTO竞争，以防止热休克反应基因中5′UTR的去甲基化，从而增强它们在细胞质中以不依赖于帽子结构的方式翻译[63]。同样在DNA紫外线损伤后，METTL3催化产生的m6A修饰的RNA迅速定位在损伤部位，招募DNA聚合酶κ(Pol κ)促进损伤修复[64]。m6A甲基化在设定昼夜节律周期和决定生物钟节律和稳定性方面的重要生理功能。m6A的缺失则延长了生物钟基因Per2和Arntl成熟mRNA在细胞核存在的时间[65]。m6A甲基化修饰还可以影响细胞中脂类代谢。研究发现抑制AMPK可以促进脂质的积累，同时细胞中m6A甲基化水平降低。进一步研究发现，AMPK通过调控FTO的表达，改变骨骼肌细胞中m6A甲基化水平，进而调节脂质代谢[66]。

多能干细胞(ESCs)具有2个基本属性—自我更新和多能性。在近期的研究中METTL3完全敲除的小鼠胚胎干细胞(mESCs)和上皮细胞表现出自我更新的增加，但分化为成熟心肌细胞和神经元的能力明显受损[53,67]。在免疫缺陷小鼠皮下注射METTL3敲除的mESCs后，在体内产生了更大但分化较差的畸胎瘤，这说明m6A在mESCs中可以抑制细胞自我更新，促进分化[67]。在待激活态的小鼠上胚层干细胞(mEpiSCs)向幼稚态mESCs的重编程过程中，METTL3的早期缺失破坏了待激活态细胞的多能稳定性，破坏了它们的重编程能力，而METTL3的晚期缺失则显著提高了mEpiSCs的重编程效率[53]。值得注意的是，敲除METTL3可以导致胚胎死亡[53]。另一项研究表明在小鼠胚胎成纤维细胞(MEFs)中过表达METTL3，导致m6A修饰显著增加，关键多能基因表达增强，重编程效率提高。这表明MEF重编程为多能性细胞需要m6A修饰[68]。这些研究表明，m6A修饰可以精确调控干细胞的分化和重编程。

3.3 人类疾病

目前已经发现m6A RNA甲基化在人类疾病尤其是癌症的发生发展过程中具有重要调控功能，m6A功能的失调与各种癌症密切相关。在人骨髓白血病细胞系中，METTL3的缺失诱导细胞分化和凋亡，并在体内延缓受体小鼠白血病的发展[69]。METTL14在急性骨髓白血病(AML)细胞系中也高表达，通过调控肿瘤基因MYB和MYC的m6A甲基化来发挥其致癌作用[70]。同样WTAP在AML细胞系中的缺失会导致癌细胞增殖减少，分化凋亡增加[71]。然而在某些类型的AML中降低m6A RNA的甲基化发挥了致癌功能。例如，在t(11q23)、t(15；17)、FLT3-ITD类型的AML细胞系中FTO显著高表达，它能够诱发原癌基因介导的细胞转化从而引发白血病，FTO还可以抑制全反式维甲酸(ATRA)治疗后引起的急性骨髓白血病细胞的分化[72]。

在乳腺癌(BC)的发展过程中，METTL3通过增加m6A修饰促进HBXIP基因的表达，形成HBXIP/let-7g/METTL3/HBXIP的正反馈回路，导致乳腺癌细胞增殖加快[73]。在人类胰腺癌(PC)中，YTHDF2的mRNA和蛋白水平上均上调，并促进癌细胞增殖和上皮-间质转化(EMT)[74]。METTL14可以与DGCR8相互作用，以m6A依赖的方式调控pri-miRNA126的成熟，从而抑制肝癌细胞的转移能力[75]。然而最近的研究表明，METTL3在人类肝癌细胞(HCC)中上调，体外细胞实验证实敲除METT3后能够显著抑制肝癌的增殖迁移以及转移。研究发现METTL3可以显著增强SOCS2基因mRNA甲基化修饰，以依赖于YTHDF2的方式降解，最终导致肝癌恶化[76]。这两项研究结果大相径庭，意味着在RNA甲基化领域，目前仍然有较多的工作等待我们去挖掘和开发。

胶质瘤干细胞(glioblastoma stem cell，GSC)是恶性肿瘤内存在的具有自我更新和分化能力的细胞。研究发现，在GSCs细胞中敲低METTL3和METTL14，m6A甲基化水平降低，可以促进原癌基因ADAM19、EPHA3和KLF4 mRNA的表达，促进细胞的生长和分化。然而，过表达METTL3或者敲低FTO则抑制GSC的生长和分化从而抑制肿瘤的发生，延长了GSC移植小鼠的寿命[77]。最新的研究表明，RNA m6A修饰通过调控树突状细胞的溶酶体组织蛋白酶翻译效率，影响肿瘤抗原特异性的T细胞免疫应答。在小鼠中敲除YTHDF1可以增强肿瘤抗原特异性CD8+T细胞的应答反应。进一步研究表明，多个树突细胞溶酶体组织蛋白酶的mRNA上均存在m6A甲基化修饰，且可以被YTHDF1识别，进而促进其翻译[78]。

4 结语与展望

与DNA甲基化类似，RNA m6A修饰是由甲基转移酶和去甲基酶以及识别蛋白所催化的动态可逆的修饰方式。它广泛存在于原核生物和真核生物中的各种RNA上。m6A可以通过调控RNA稳定、定位、运输、剪接和翻译来发挥重要的生物学功能。已知m6A修饰与胚胎发育、癌症的发生转移、免疫应答、干细胞自我更新分化、脂类代谢、DNA损伤修复、热休克反应的控制，昼夜节律的控制等均有紧密的联系。然而，m6A甲基化修饰在牛上的研究还未起步，尤其是在遗传育种方面是否也发挥重要调控作用及其机制尚不清楚，这还需要科研工作者的进一步深入探索。