粒细胞集落刺激因子影响肿瘤转移的研究进展*

肿瘤的侵袭转移为癌症患者死亡的主要原因之一，其发生发展涉及多因素调控、多步骤的协同作用。肿瘤细胞恶性增殖，从原发灶或转移灶脱落，浸润穿透基底膜血管内灌注或进入淋巴管[1-2]。在免疫杀伤作用下，缺乏活力和变形性的肿瘤细胞会在循环系统中被清除，仅极少部分的肿瘤细胞能够增殖形成新的病灶。以往有关肿瘤转移的研究多集中在肿瘤细胞本身，近年研究发现肿瘤细胞与肿瘤微环境中的相关因子相互作用可促进肿瘤的生长和转移。粒细胞集落刺激因子（granulocyte colony stimulating factor，G-CSF）为调节骨髓细胞生长的重要生长因子之一，临床上G-CSF多用于预防和治疗放化疗后所造成的粒细胞缺乏。

1 粒细胞集落因子和粒细胞集落因子受体

G-CSF也称为集落刺激因子3（colony stimulating factor 3，CSF3），是一种含有174个氨基酸的糖蛋白（19.6 KDa），主要由来自骨髓基质的成纤维细胞和内皮细胞以及免疫活性细胞（单核细胞、巨噬细胞）合成[3]，可通过启动G-CSF受体（granulocyte colony stimulating factor receptor，G-CSFR）的二聚化来刺激骨髓中前体细胞的增殖、分化和活化。G-CSF为造血和免疫系统的主要细胞外调节器，其不仅可以将成熟前体细胞转变为完全分化的中性粒细胞，还可以增强其功能活性，主要负责缩短干细胞静止期，促进成熟的中性粒细胞自骨髓释放到外周血和组织当中。G-CSF最早发现于20世纪80年代，Burgess等[4]在含有内毒素血清（endotoxin serum，ES）的半固态琼脂培养基中培养白血病细胞时，发现一种能够诱导骨髓单核细胞白血病细胞集落分化的物质，并命名这种物质为G-CSF。G-CSFR也称为CD114抗原，由CSF3R基因编码，定位于染色体1p32-35，该基因含有17个外显子[5]，是Ⅰ类细胞因子（或血细胞生成素）受体超家族的成员，该家族成员在血液和免疫细胞的发育和功能中发挥重要作用。G-CSFR是由813个氨基酸组成的跨膜蛋白，其中604个氨基酸作为细胞外结构域、26个氨基酸在跨膜结构域中、183个氨基酸在细胞内细胞质结构域中。研究表明，约90%的人胃癌和结直肠肿瘤中存在G-CSFR的高表达[6]，约60%卵巢癌中存在G-CSFR水平的显著升高[7]。GCSF与其受体G-CSFR相结合可促进骨髓细胞的增殖、分化和迁移。

2 G-CSF在实体肿瘤中的表达

肿瘤微环境中众多细胞因子参与调控肿瘤的发生发展。正常生理条件下，G-CSF由机体产生，人体血清中G-CSF的含量较低（＜100 pg/mL）。应激状态下，血清G-CSF含量上升，甚至可以超过2000pg/mL。除了正常组织细胞，多种恶性肿瘤细胞和肿瘤基质细胞也能够分泌G-CSF，并且G-CSF的产生可能与肿瘤的发生、发展及侵袭转移存在着密切的关系。最早对于G-CSF的认识多由血细胞分泌[8]。后续研究发现，肿瘤来源的基质成纤维细胞或肌成纤维细胞也能产生G-CSF[6]。Asano等[9]报道了能够产生G-CSF的肺癌。此后，陆续有报道多种恶性肿瘤可以产生G-CSF，如膀胱癌、宫颈癌、乳腺癌、胆囊癌和黑色素瘤等实体肿瘤细胞系可以分泌G-CSF[10-17]。产生G-CSF的肿瘤会对机体产生下述反应：1）肿瘤组织中存在G-CSF的表达；2）血清中G-CSF的活性升高；3）机体产生发热，白细胞（white blood cell，WBC）急剧增加；4）肿瘤切除后机体内WBC含量减少[15，18]。Aliper等[17]报道肿瘤细胞所产生的G-CSF和G-CSFR的表达在介导非造血肿瘤细胞恶性进展中均发挥重要作用。研究报道，G-CSF为肿瘤增殖转移所必需的自分泌生长因子[18-19]。研究发现，肿瘤细胞可以通过旁分泌的方式释放G-CSF作用于肿瘤，来促进肿瘤生长和肿瘤细胞的基质侵入[6-7]。诸多研究检测到产生G-CSF的肿瘤细胞系多发现于癌症的中晚期，且与细胞分化程度以及不良的预后相关，G-CSF可能是潜在的肿瘤标志物[12，19]。

3 G-CSF对于肿瘤细胞的影响

研究发现，G-CSF不仅可以促进肿瘤细胞的增殖，也可以通过募集炎症细胞刺激头颈部鳞状细胞癌细胞系的增殖和迁移[20]。应用G-CSF处理胃和结直肠癌细胞增加其增殖和迁移，并且与未处理的对照组细胞相比，胃癌和结肠癌细胞均表现出增殖程度存在剂量依赖性。此外，G-CSF扩增癌细胞的干细胞亚群[6]。研究报道，利用人胃癌GC细胞（SGC7901）与不同浓度（0、10、50、100 ng/mL）的重组人G-CSF（recombinant human GCSF，rhG-CSF）孵育不同时间（24、48、72、96 h）后，使用CCK-8检测显示G-CSF可以促进GC细胞的增殖，Transwell实验显示G-CSF处理显著促进了GC细胞的迁移能力[21]。G-CSF通过激活STAT3的磷酸化促进膀胱癌细胞的存活和生长[10]。亦有研究在体外采用G-CSF处理辐射诱导的小鼠结肠癌细胞（CT26）对于细胞毒性和细胞活力，及在人尤文氏肉瘤细胞中的影响[16，22]，均未观察到G-CSF对于上述两种细胞体外增殖的影响。

4 G-CSF对肿瘤转移作用的可能机制

2010年Kowanetz等[23]首次发现G-CSF在肿瘤转移中的直接作用。使用外源性G-CSF促进了乳腺癌肺转移，而针对G-CSF的中和抗体在一系列乳腺癌模型中抑制了肺转移。G-CSF可以通过动员肿瘤相关中性粒细胞，刺激骨髓干细胞成熟、增殖和迁移到外周循环等途径来促进肿瘤生长和转移。尽管为一种细胞生长因子，但其对于实体瘤或肿瘤细胞转移的具体作用机制还未明确。

4.1 G-CSF动员循环内皮祖细胞促进肿瘤血管生成

肿瘤的生长、侵袭转移能力与新生血管的生成、组织的修复有着密切的联系。由于血液供应对于实体肿瘤是必需的，因此肿瘤的生长高度依赖于血管生成和新毛细血管的形成，为肿瘤提供血液、营养和氧气[24]。血管生成也是个多步骤的过程。在常规观点中，血管生成生长因子从静息状态下被激活，从而介导血管壁相关内皮细胞（endothelial cells，EC）的局部增殖和迁移形成新生血管。然而，最近的研究表明，具有分化为成熟EC潜能的循环细胞，即所谓的循环内皮祖细胞（endothelial progenitor cells，EPCs），也可能有助于肿瘤血管的生成[25]。同时，肿瘤微环境中也存在多种促进血管生成的细胞因子，这些因子能够促进肿瘤的血管生成。G-CSF为一种存在于肿瘤中的造血生长因子，可以募集中性粒细胞、单核巨噬细胞以及动员骨髓（bone marrow，BM）来源的EPCs等到达肿瘤组织及其邻近部位，诱导肿瘤血管生成和抑制肿瘤细胞凋亡，从而促进肿瘤的发展[26]。通过G-CSF的免疫调节作用对肿瘤生长和肿瘤血管生成的间接作用是显而易见的。研究表明，G-CSF可以促进肿瘤血管生成，从而导致结肠癌肿瘤细胞的增殖，这一效应是由骨髓衍生的内皮祖细胞促进，后者随后形成肿瘤血管系统的一部分[27]。EPCs为具有高增殖和分化潜能的干细胞亚型，主要来源于BM和外周血（peripheral blood，PB）是在血管新生和血管生成中起重要作用的能循环、增殖和分化为成熟血管内皮细胞的一类前体细胞，亦称为血管母细胞或血管内皮干细胞。EPCs表达几种细胞表面标记，这些标记根据其来源而异，易于识别。BM衍生的EPCs是表达CD34（祖细胞标记物）、CD133（早期造血干细胞标记物）、VEGFR-2（内皮细胞标记物）等细胞表面分子的未成熟细胞。而PB衍生的EPCs是更为成熟的细胞，除了表达VEGFR-2之外，还表达多种内皮谱系标志物，如血小板内皮细胞黏附分子-1（CD31）和黑色素瘤细胞黏附分子（CD146），而VEGFR-2、CD34高表达，CD133低表达。有研究从人外周血中首次分离出能分化成为血管内皮细胞的前体细胞，考虑其参与血管生成有助于血管重塑，并将其命名为内皮祖细胞[26]。内皮祖细胞从BM动员并释放到PB中，随后归属到需要血管重建的位置，最终参与血管生成和血管修复[27]。骨髓中的EPCs含量较低，较难获得且具有高度的侵袭性，获得高数量EPCs的关键是需要使用合适的信号因子将其招募到PB中[28]。研究表明，G-CSF可以通过间接作用于骨髓基质细胞上的受体，动员BM来源的EPCs到外周血中，EPCs随血液循环在肿瘤组织和其邻近部位聚集，最后整合进新生成的血管中，促进肿瘤血管生成，增加毛细血管数量。来自癌症动物的模型表明，G-CSF通过增加BM衍生的EPCs动员和分化来促进肿瘤生长[26]。肿瘤细胞分泌的G-CSF可以动员EPCs进入外周血中，刺激EPCs活化。与肿瘤模型小鼠相比，给予外源性G-CSF的非荷瘤小鼠循环内皮祖细胞不增加。表明需要肿瘤相关的G-CSF动员骨髓来源的EPCs，促进肿瘤血管生成[29]。Okazaki等[25]研究发现，接种Lewis肺癌细胞或KLN205细胞的荷瘤小鼠并用G-CSF处理，G-CSF通过动员循环内皮祖细胞促成肿瘤中血管形成，加速了肿瘤生长和肿瘤内血管密度。

4.2 G-CSF动员MDSCs促进肿瘤生长和转移

G-CSF为中性粒细胞运输的必须调节因子，在多种肿瘤中高度表达。髓源性抑制细胞（myeloid suppressor cell，MDSCs）是在癌症患者和动物模型中相对新发现的白细胞群，通过免疫抑制的多种机制刺激肿瘤血管生成或促进肿瘤细胞侵袭、转移来增强肿瘤进展。肿瘤细胞与宿主免疫系统之间的相互作用导致免疫编辑，刺激肿瘤免疫逃逸，最终导致肿瘤侵袭、转移和复发[30]。MDSCs既存在于血液系统中，也存在于疾病发生部位，是肿瘤微环境中的重要免疫成分，可以介导荷瘤小鼠和癌症患者免疫抑制。在小鼠模型中，MDSCs亚群可以分为单核细胞和粒细胞亚群，且2种细胞亚群被证明具有相同的免疫抑制作用。单核细胞MDSCs被命名为CD11b+Ly6ChiLy6G-（或CD11b+GR-1low），而粒细胞MDSCs被命名为CD11b+Ly6ClowLy6G+（或CD11b+GR-1hi）[31]。在人类中被定义为具有免疫抑制能力的骨髓细胞异质群体MDSCs可细分为3个主要类群：1）单核细胞MDSCs（monocyte MDSCs、M-MDSCs），在表型和形态学上与单核细胞相似；2）粒细胞多形核MDSCs（polymorphonuclear MDSCs，PMN-MDSCs），与低密度中性粒细胞相似；3）早期MDSCs（early MDSCs、e-MDSCs），包含多种具有免疫抑制能力的未成熟祖细胞。M-MDSCs和PMN-MDSC来源于常见的骨髓祖细胞，并由控制正常骨髓细胞生成的髓样生长因子在双信号过程中驱动。如代表“信号1”的G-CSF、粒细胞-巨噬细胞CSF（granulocyte-macrophage CSF，GM-CSF）、巨噬细胞CSF（macrophage CSF，M-CSF）和肿瘤产生的其他生长因子介导未成熟髓样细胞的扩增，以及持续和（或）低水平的炎性细胞因子和损伤相关模式分子（danger-associated molecular patterns，DAMPs）控制异常骨髓细胞生成和免疫抑制性MDSCs活化的“信号 2”[30，32]。在病理条件下活化的MDSCs会导致活性氧（reactive oxygen species，ROS）和活性氮（reactive nitric species，RNS）的过量产生，其消除T细胞介导的细胞毒性并促进肿瘤的发展和侵袭转移[33]。在肿瘤微环境中，MDSCs诱导细胞因子由肿瘤细胞和肿瘤基质细胞产生。

G-CSF是MDSCs迁移、增殖和功能维持的关键调节因子，同时也是诱导中性粒细胞产生以及介导其从骨髓动员到外周血的必须调节剂。肿瘤来源的G-CSF可以扩增、募集、活化MDSCs，使其发挥免疫抑制功能。Li等[33]研究显示，G-CSF不仅可以将MDSCs募集到存在炎症的结肠组织中，还可以保持其未成熟状态，促进其增殖和抗凋亡能力。抗G-CSF处理小鼠可以减少MDSCs的募集，使肿瘤体积减小。肿瘤衍生的G-CSF通过促进肿瘤血管生成，动员MDSCs诱导免疫抑制使宫颈癌患者产生化疗耐药[34]。Kuroda等[35]研究发现，G-CSF募集的MDSCs通过产生前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）在宫颈癌中诱导癌症干细胞，且能够上调MDSCs表面的Bv8蛋白，通过免疫抑制途径绕过抗VEGF介导的抗血管生成[36]。

4.3 G-CSF通过激活JAK/STAT3信号通路促进肿瘤转移

癌症进展为癌细胞与其微环境之间复杂相互作用的结果。肿瘤细胞、免疫细胞和基质之间的细胞间通信是肿瘤微环境的特征，有助于建立促进肿瘤生长和转移的生态位。而肿瘤细胞内的JAK/STAT3信号通路提供支持细胞增殖和活化的关键轴，调控构成肿瘤微环境的非转化细胞的许多活动[37]。JAKSTAT信号通路为近年来发现的一条由细胞因子刺激的信号通路，参与细胞的增殖、分化、凋亡以及免疫调节等许多重要的生物学过程。其主要由酪氨酸激酶相关受体、酪氨酸激酶和转录因子（STAT）3个部分组成[38]。机体的免疫系统对于抗肿瘤反应是必不可少的，当转化细胞获得使其逃避免疫监视的能力时，肿瘤的发展和侵袭转移就会增强。与癌症相关的炎症细胞因子和其他分子驱动因子，其在促进和抑制肿瘤发生方面发挥着双重作用。这类细胞因子，如白介素、干扰素和G-CSF等，其与相应受体结合后可以激活固有的JAK/STAT3信号通路，诱导能够使转化细胞存活和增殖的转录基因。这类细胞因子还可以STAT3依赖的方式调节免疫细胞的效应功能，进而支持肿瘤的发生和免疫抑制[37]。G-CSF通过JAK2/STAT3信号通路刺激人胃癌细胞的增殖和迁移，并加速内皮细胞新生血管[21]。STAT3转录因子是干细胞自更新，癌细胞存活和炎症反应的重要调节因子[39]。Agarwal等[14]研究发现，G-CSF可以特异性的与其受体G-CSFR结合，通过G-CSF-G-CSFRSTAT3反馈环磷酸化激活神经母细胞瘤中癌症干细胞亚群内的STAT3，促进体外神经母细胞瘤集落的形成和增殖，促进体内神经母细胞瘤的形成和侵袭转移。另一项研究结果显示[40]，肿瘤分泌的G-CSF作为自分泌因子，被其受体G-CSFR识别并激活细胞内JAK/STAT3信号传导通路，从而触发非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）的上皮细胞-间充质转化（epithelial-mesenchymal cell transition，EMT）来促进肿瘤的侵袭转移。进一步研究还发现，G-CSF和G-CSFR均在高级别卵巢肿瘤和卵巢癌细胞中表达，并通过JAK/STAT3的G-CSF/G-CSFR信号转导参与卵巢癌细胞迁移和对卵巢癌细胞凋亡的抗性[41]。

5 G-CSF的临床应用

临床上作为调控外周血中性粒细胞数量的关键因子，rhG-CSF多用于缓解肿瘤患者放、化疗后骨髓抑制所引起的粒细胞缺乏或减少，已成为治疗中性粒细胞减少症和癌症患者发热性中性粒细胞减少症的一、二级预防的主要药物。然而G-CSF或许可以促进实体肿瘤的疾病进展，一项rhG-CSF应用于急性髓系白血病（acute myeloid leukemia，AML）患者的预后影响研究发现[42]，G-CSF的使用不利于AML患者的预后，可能因其白血病细胞表面具有G-CSFR的表达。有研究表明，rhG-CSF会促进MDSCs免疫逃逸以及促进肿瘤血管生成[43]。目前，有关G-CSF的临床运用对于肿瘤进展和疾病预后的研究较少。因此，亟需深入研究G-CSF作用于肿瘤本身的机制以及做好临床用药的严格把控。

6 结语

综上所述，G-CSF为一种促炎细胞因子，可以从骨髓扩增和动员造血前体细胞。当宿主受到感染或有组织损伤时，G-CSF可以动员中性粒细胞。因放、化疗所引起严重的粒细胞减少症可通过给予G-CSF来缓解。肿瘤所分泌的G-CSF可以通过多种途径促进肿瘤的侵袭和转移，G-CSF可能是潜在的肿瘤标志物，可用于临床中监测肿瘤的发展。