AMPK介导运动改善2型糖尿病骨代谢紊乱的明星分子

陈祥和 余慧琳 徐帅 杨康 张宪亮 赵仁清 孙开宏

1. 扬州大学体育学院，江苏 扬州 225127 2. 淮阴师范学院体育学院，江苏 淮安 223001 3. 山东大学体育学院，山东 济南 250000 4. 扬州职业大学体育学院，江苏 扬州 225127

2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)作为因能量代谢紊乱导致的继发性疾病，胰岛素抵抗(insulin resistance，IR)和高血糖将引起组织器官结构及功能受损，导致骨质疏松等并发症发生[1]。骨细胞分泌的非羧基化骨钙素(uncarboxylated osteocalcin，ucOCN)可调控葡萄糖及脂肪转化和利用，影响能量代谢；同时能量代谢亦通过反馈环路：瘦素-下丘脑-交感神经调节骨形成，影响骨代谢[2]。AMP依赖蛋白激酶(AMP-dependent protein kinase，AMPK)是能量代谢关键调节器，其α亚基N-末端含有保守丝氨酸(serine，Ser)/苏氨酸(threonine，Thr)激酶区，该区域保守Thr-172位点被磷酸化后激活下游相应信号途径来调控骨代谢、能量代谢、心血管系统等。

T2DM骨代谢紊乱发生中，破骨细胞(osteoblast，OC)分化及骨吸收异常高于成骨细胞(osteoblast，OB)主导的骨形成。而OB或OC分化及功能发挥均是高耗能(即消耗ATP)过程，ATP/AMP比值下降激活OB和OC内AMPKα表达[3]。而敲除AMPKα后会骨代谢紊乱，但敲除β和γ亚基对骨的影响不显著。运动是改善T2DM骨代谢紊乱的有效手段，可显著促进OB分化及骨形成并抑制OC分化及骨吸收。而不同方式运动因对骨产生的力学刺激方式不同(直接作用力和间接作用力)，故对骨产生的作用效果存在较大差异。直接作用力促骨形成、抑制骨吸收的作用效果显著优于间接作用力，且可显著上调骨中AMPK表达[4]。然而，有关不同方式运动通过调控AMPK介导T2DM OB或OC分化及功能的相关研究有待揭示。故本研究对AMPK在运动影响T2DM OB和/或OC分化及功能的相关研究进行梳理，以期阐明能量代谢在T2DM骨代谢中的作用机制，为AMPK介导运动改善T2DM骨代谢的分子机制提供一定的理论基础。

1 AMPK简介

AMPK由催化亚基α及调节亚基β和γ构成，可调控糖/脂代谢、线粒体功能、IR、细胞自噬、神经功能等生理过程[5-6]。骨代谢中，各AMPK亚型所扮演的角色不同。研究发现，AMPKα1-/-小鼠松质骨和皮质骨骨体积分数(bone volume fraction, BV/TV)、骨小梁数量(trabecular number，Tb.N)、骨面积和横截面积等骨组织形态计量学指标显著下降；AMPKα2-/-敲除小鼠胫骨骨量变化却不显著[7]。AMPKβ1-/-小鼠松质骨BV/TV和Tb.Th显著下降，而皮质骨骨组织形态计量学参数变化不显著，AMPKβ2-/-小鼠骨组织形态相关指标变化无差异[8]。有关AMPKγ介导骨代谢的相关研究尚待揭示。上述研究发现，AMPKα1亚基介导T2DM骨代谢紊乱发生，其他亚基作用不显著。

2 T2DM导致骨代谢紊乱发生

T2DM骨代谢紊乱发生与高血糖、IR等导致的OB分化及骨形成下降和OC分化及骨吸收能力异常升高密切相关。并且，该过程受关键分子、激素等调控。高血糖造成低血钙、镁导致甲状旁腺素(parathyroid hormone，PTH)分泌增加，抑制核因子κ B受体活化因子配体(receptor activator for nuclear factor-κ B ligand，RANKL)，激活核因子κB受体激活因子(nuclear factor kappa B receptor activator，RANK)，促进OC分化及骨吸收[9]。亦可通过骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein，BMPs)/Smads信号途径、胰岛素样生长因子(insulin-like growth factors, IGFs)及激活白介素-6(interleukin, IL-6)来抑制OB分化及其凋亡[10]。并且，高血糖导致糖基化终末产物(glycosylation end product, AGEs)增多，抑制OB增殖及骨形成的同时并作用于AGEs受体，产生IL-1等促进OC分化，导致骨吸收增强[11]。研究发现，胰岛素分泌减少及IR导致OB分化和骨形成能力及OC骨吸收能力增强，骨重塑下降，骨中有机质Ⅰ型胶原蛋白(type I collagen，Col1)等有机质减少，无机质流失，骨质疏松发生[12]。磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase, PI3K)-蛋白激酶B(protein kinase B, AKT)途径、核因子κB(nuclear factor-kappa B, NF-κB)途径、microRNA等信号途径激活，上调组织蛋白酶K(cathepsin K，CTSK)、活化T细胞核因子c1(activated T cell nuclear factor c1，NFATc1)、激活子蛋白-1(activator protein 1，AP-1)等并下调Runx2、Col1、PHEX等表达进而调控OC分化和骨吸收能力及OB分化和骨形成能力，抑制骨重塑，导致T2DM骨质疏松[13-14]。T2DM机体内性激素分泌减少及脂肪细胞分泌产生的瘦素增多，亦导致骨基质和骨量减少[15]。近来发现，能量代谢紊乱介导T2DM骨质疏松。AMPK作为调控能量代谢的关键酶，与沉默信息调节因子(silent information regulator 1, SIRT1)结合后调控下游哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)、辅助激活因子-1α(PPARγcoactivator -1α, PGC-1α)等能量代谢调控因子，作用于OB和OC分化及功能，调控骨代谢[16]。然而，有关AMPK介导T2DM骨代谢紊乱的研究却较少。

3 AMPK介导T2DM骨代谢紊乱作用机制

3.1 AMPK介导T2DM OB分化

OB是主导骨形成细胞，由骨髓间充质干细胞(bone marrow stem cells, BMSCs)分化产生。研究发现，转化生长因子β(transforming growth factor-β，TGF-β)/BMPs、Wnt/β-catenin、Notch、Hedgehog等关键途径可直/间接作用于Runx2、Osterix等靶基因，调控OB分化[17]。而生长分化因子-11(growth differentiation factor 11，GDF11)、Orai1、micro RNAs(如miR-764-5p、miR-338-3p、等)等关键分子亦起重要作用[18]。OB分化及骨形成紊乱造成骨代谢失调。T2DM大鼠BMSCs分化产生的OB数量和骨形成能力被抑制，使得骨形成下降[19]。在研究PPARγ抑制剂对T2DM小鼠脂肪细胞分化影响时，发现脂肪细胞分化增多的同时，OB数量减少且成骨能力下降[20]。对T2DM小鼠分化产生的OB进行碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)染色，发现OB数量和骨形成能力显著下降[21]。综上表明，T2DM骨质疏松发生与OB数量和骨形成能力下降密切相关。自发性T2DM小鼠(KK-Ay小鼠)OB合成Col1等有机质减少，造成钙、磷等沉积障碍，使得BMD下降及骨组织形态结构退化[12]。并且，T2DM OB自噬和凋亡增加，亦会负向调控OB分化及骨形成[22]。

T2DM抑制OB分化过程受众多信号途径或分子调控。AMPK磷酸化后将开启一系列复杂信号途径，加快ATP合成并减少ADP消耗。并且，其作为应答代谢压力的传感器，当乙酰辅酶A羧化酶(acetyl-CoA carboxylase，ACC)等底物被抑制后，可抑制脂肪酸和胆固醇合成途径(即分解ATP的能量消耗途径)[23]。研究发现，AMPK通过胰岛素途径调控T2DM发生，当胰岛素信号途径被抑制(如IR)时，其可作为备用途径参与糖脂代谢，改善IR[24]。另外，AMPK α1亚基敲除小鼠出现高血糖、高血脂且骨组织病理表征与T2DM小鼠表型相似。后续研究发现，AMPKα1-/-小鼠高糖高脂饲料喂养8周后，骨组织表征与T2DM的病理特征更一致。提示，AMPKα1基因缺失是T2DM发病及骨质疏松症发生的主因。

T2DM骨质疏松症与OB分化减少及骨形成能力下降息息相关[25]，但其分子调控机制尚不清晰。AMPK是一多底物Ser/Thr蛋白激酶，近来证实，其在T2DM发病过程中扮演关键调控作用。将其敲除后，eNOS-NO途径下调BMP-2及下游Runx2表达，抑制T2DM大鼠OB分化及骨形成能力[26]。Meier等[27]在综述T2DM对骨影响时，发现T2DM骨质疏松甚至骨折发生与AMPK/USF-1/SHP途径被抑制后下调Runx2、Dlx5和Osterix等表达，进而抑制OB分化及骨形成密切相关。当利用DN-AMPK(AMPK抑制剂)抑制MC3T3-E1中AMPK磷酸化后，通过孤儿核受体SHP调控Runx2反式激活，降低OB骨形成及标志基因：ALP、骨钙素(osteocalcin，OCN)等表达[28]。T2DM大鼠骨中AMPK失活后，骨形成特异性基因：ALP、OCN、Runx2/Cbfa1 等表达下调会抑制OB分化；体外研究发现，激活AMPK可上调骨形成基因ALP、OCN、Runx2/Cbfa1 等表达，促进OB分化及活性[29]。

3.2 AMPK介导T2DM OC分化

作为主导骨吸收的OC，其分化及骨吸收能力增强是T2DM骨质疏松发生另一主因，但有关T2DM促进OC分化的相关研究尚存争议。Kitamura等[30]研究发现，T2DM金鱼骨量下降与骨基质中胶原纤维的非酶糖基化下降相关，而其TRAP活性变化不显著。但有研究却发现，T2DM小鼠矿化染色呈骨质疏松表征，且骨中OC活性(即TRAP活性)增强[31]。胫骨硬组织切片TRAP染色后多核OC数量增多，其松、皮质骨：BV/TV、Tb.N、Tb.Th等指标显著下降[32]。这与T2DM小鼠异位骨化障碍导致的OC数量增多及骨吸收功能增强密切相关[33]。上述研究结果差异，可能与研究所用动物模型及所检测组织的形成机制及组分存在较大差异有关。但后续研究证实，T2DM OC分化增加导致骨质疏松发生。

AMPK是介导T2DM骨质疏松发生的能量代谢调节器，但有关其调控OC分化及骨吸收的研究较少。OC分化及其骨吸收是高耗能过程，AMPK ser172位点磷酸化后抑制去卵巢小鼠OC分化、融核[34]。并且，AMPK作为RANKL负调节剂，激活后抑制其表达，进而激活RANK及下游C-fos-NFATc1途径，上调关键靶基因Oscar、CTSK、Atp6v0d2等表达促进OC分化及其骨吸收能力，导致骨质疏松发生。T2DM抑制骨中AMPK表达，并且AMPKα1-/-小鼠表型与T2DM小鼠表型高度一致，说明其α1亚基敲除是T2DM发病的关键因素。KK/UpjAy/J (KKAy) 小鼠分化产生OC及多核OC数量增多，TRAP活性增强[35]。表明，T2DM骨代谢紊乱发生与OC分化增多且骨吸收增强有关。因此，AMPK调控T2DM促OC分化及骨吸收能力，其分子机制与RANKL诱导的C-fos-NFATc1途径有关。

4 AMPK在运动改善T2DM骨代谢紊乱中的作用机制

运动是改善骨代谢的重要手段，不同运动对骨产生的力学刺激在促OB分化和骨形成及抑制OC分化和骨吸收的作用效果不同(直接作用力优于间接作用力)[36]。T2DM抑制OB分化及骨形成，但有关运动影响此过程的相关研究较少。人体研究中，T2DM患者肥胖导致的体重增加虽对骨产生力学刺激，但OB凋亡增加、骨形成能力下降，松质骨和皮质骨骨组织形态结构退化[37]。而动物研究发现，下坡跑产生的直接力学刺激可通过激活T2DM小鼠骨中TGF-β/BMPs途径，使得BMSCs分化产生的OB数量增多、骨形成能力增强[38]。体外研究中，流体剪切力促进T2DM小鼠体外培养的OB骨形成能力[39]。分析以上结果，体重对机体产生的直接力学刺激强度较小，而下坡跑和流体剪切力对T2DM骨或OB产生的直接力学刺激较大(包含体重对骨的力学刺激)，促OB分化及骨形成能力作用更大。运动调控T2DM OB分化及骨形成的分子机制尚不完善，仅证实了TGF-β/BMPs途径。AMPKα1调控T2DM发病，敲除该基因后小鼠表型与T2DM小鼠表型高度一致。并且，下调AMPK表达抑制T2DM的OB分化及骨形成[40]。AMPK表达下调，通过eNOS-NO途径抑制BMP-2及下游Runx2，抑制T2DM大鼠OB分化及骨形成能力[26]。体外研究亦证实，激活AMPK后上调骨形成标志基因ALP、OC、Runx2/Cbfa1 等，促进OB分化及其活性[41]。既然运动可显著改善骨中AMPK表达及T2DM的OB分化和骨形成，并且AMPK介导T2DM抑制OB分化及骨形成过程。那么要问，AMPK是否介导运动改善T2DM OB分化及骨形成？ Kanazawa[42]研究发现，运动激活T2DM小鼠骨中AMPK，并促进OB分化及骨形成，改善骨量和骨组织形态结构。因目前相关研究较少，其分子机制尚不清晰。敲除AMPK后，T2DM小鼠骨中eNOS和BMP-2表达及OB分化被抑制[43]。然而，运动可通过激活eNOS和BMP-2改善T2DM小鼠骨质疏松[44]。eNOS和BMP-2作为调控骨形成两关键分子，eNOS可通过PI3K/AKT/ eNOS途径调控BMSCs向OB分化；而BMP-2作为BMPs重要亚型，可通过Smad途径调控OB分化。综上，运动可通过激活AMPKα1表达，促进T2DM OB分化及骨形成能力，改善骨形成代谢。其机制与AMPK介导的Wnt/β-catenin、Runx2等密切相关。并且，骨形成代谢受TGF-β/Smad、Hedgehog、Notch等众多途径调控，那么，运动是否可通过以上信号途径来影响T2DM OB分化及骨形成？

T2DM骨质疏松症发生与分化产生的OC和多核OC数量增多，骨吸收能力增强，导致骨组织微细结构退化密切相关。运动作为改善T2DM骨质疏松的重要手段，其不仅可上调T2DM小鼠骨中AMPK表达并可通过调控C-fos/NFATc1、RANKL/RANK/OPG、PI3K/AKT、ERK等途径抑制T2DM OC分化及骨吸收[44]。敲除AMPK后，C-fos/NFATc1途径被抑制，T2DM的OC分化及骨吸收增强。AMPK亦可通过RANKL/RANK/OPG分子轴、PGC-1β、PI3K/AKT和ERK等进行调控[45]。那么，既然AMPK介导T2DM发生，又介导其OC分化、融核及骨吸收。不禁要问，AMPK是否介导运动抑制T2DM OC分化及骨吸收？研究发现，游泳可显著提高T2DM大鼠骨骼肌AMPK表达。但是，运动介导T2DM骨中AMPK表达，调控OC分化及骨吸收能力的研究较少。综合国内外相关研究，发现：①T2DM促进OC分化及骨吸收；②AMPK敲除促进T2DM OC分化及骨吸收；③运动(尤其是直接作用力)抑制T2DM OC分化及骨吸收。因此，运动抑制T2DM OC分化及骨吸收的分子机制，与AMPK活化后，抑制C-fos/NFATc1、RANKL/RANK/OPG、PI3K/AKT等信号途径有关。

5 总结与展望

AMPK是调控能量代谢关键分子，亦是T2DM发生基础，其激酶上的活性/调节功能域被ATP/AMP激活后，可调控OB和/或OC分化及功能发挥。通过对已有相关文献分析，发现运动激活AMPK后促进T2DM OB分化及骨形成，并抑制OC分化及骨吸收，改善骨质疏松。因目前研究较少，仍存在较多盲点：AMPK有7种亚型，每种亚型的作用及机制尚待深入研究；AMPK调控T2DM骨质疏松症的研究较多，但其分子调控网络尚不完善；不同方式运动是否均能激活T2DM骨中AMPK表达，进而调控骨代谢？哪种方式运动效果更佳？除eNOS-NO、Wnt/β-catenin等途径，是否还存在其他途径在AMPKα介导T2DM OB分化及骨形成的运动适应中发挥作用？运动激活AMPKα后，除作用于RANKL/RANK/OPG分子轴外，是否还存在其他途径发挥作用？目前AMPK介导运动影响T2DM骨质疏松症的分子调控网络尚待描绘。等等。相信，随着以上问题的解决将有助于我们深入了解T2DM骨质疏松发生的分子调控网络。并且还可让我们熟知运动状态下，AMPK调控T2DM OB分化及骨形成及OC分化及骨吸收的具体机制或网络，为以后运动改善T2DM骨质疏松症提供理论依据。