我国猪流行性腹泻病毒分子遗传变异研究浅析

张智刚 魏启超 范学伟

（1黑龙江省肇东市动物疫病预防控制中心，黑龙江肇东 151100；2哈尔滨中科基因技术有限公司，黑龙江哈尔滨150028；3黑龙江农业经济职业学院，黑龙江牡丹江 157041）

猪流行性腹泻（Porcine epidemic diarrhea,PED）是由猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）引起的猪的一种急性、高度传播性的肠道疾病。不同年龄的动物均容易感染PEDV，常引起新生仔猪呕吐、严重水样腹泻和脱水，死亡率可达100%。近年来，虽然我国乃至全球许多猪群接种了CV777株相关疫苗，但哺乳仔猪依然感染PEDV，出现高死亡率。多项研究表明，造成PED疫情暴发流行的病因为高毒力PEDV变异株，与经典CV777株的原型株相比具有显著遗传差异。因此，从分子生物学角度对PEDV进行遗传进化分析显得越来越重要。

PEDV为有囊膜的单股正链RNA病毒，分别由S基因、E基因、M基因和N基因编码的纤突蛋白（spike protein,S）、小包膜蛋白（envelope protein,E）、膜糖蛋白（membrane protein,M）、核衣壳蛋白（nucleocapsid protein,N）4种结构蛋白，以及3个非结构蛋白（复制酶1a、1b和ORF3）构成。目前研究该病毒遗传变异多对其S基因、M基因和ORF3基因进行分析比对。M基因编码M蛋白，其能诱导机体产生针对病毒的中和抗体，其作为膜糖蛋白，参与病毒粒子组装和出芽，在此过程中发挥重要作用。M基因PEDV各毒株之间高度保守，经常被研究者用来研究野生毒株的多样性，并用来对临床分离毒株之间的遗传关系进行分析比对，因此对PEDV M基因的检测分析可以用来判定PEDV流行毒株的流行类型，同时M基因目前还可以作为PEDV分子分群的重要依据。S蛋白是纤突蛋白，也是病毒重要的膜蛋白之一，是PEDV所有蛋白中抗原性最强的，它可以与宿主细胞的受体分子相互作用，从而在病毒的入侵和中和抗体的诱导方面发挥重要作用。最新研究也表明，S基因是重要的毒力基因，也常被用来对PEDV的遗传变异进行研究。ORF3蛋白能够形成离子通道，提高病毒的感染效率。ORF3基因与PEDV细胞适应性和病毒毒力有关，细胞传代致弱毒的ORF3基因会发生突变而丧失其离子通道功能，所以该基因除了用于PEDV遗传变异分析外，也可用于鉴别PEDV强、弱毒株。

有研究者对我国华南地区PEDV流行株M基因进行测序分析，结果显示，各流行株间M基因核苷酸序列与国内参考株LJB/03的同源性为96.9%～97.5%，与国内较早分离株CH/S和经典毒株CV777的同源性分别为97.5%～98.1%、97.7%～98.2%，与国内其他地区参考株的同源性为96.9%～99.7%。结果表明华南PEDV流行株，尤其近年来的广东PEDV流行株可能形成独特进化分支，广东PEDV流行株与部分国外毒株以及华南地区分离株均属于II、III群，但是亲缘关系较近，处于同一分支；与大部分属于I群的代表性毒株、疫苗株非同一系，亲缘关系较远[1]。而研究发现安徽省PEDV分离株M基因除AH1304外均在第13氨基酸位点出现E→Q突变；6个N的核苷酸与氨基酸均未出现片段的增多或者缺失的现象。同源性分析显示：M基因与参考毒株的核苷酸序列同源性分别为97.5%～100%，氨基酸同源性分别为97.8%～100%，遗传进化树分析表明分离株中AH1304株与弱毒株SD-M和attenuated DR13亲缘性最近，其余安徽毒株与2013年美国流行毒株IA1和2012年中国流行毒株AH2012亲缘关系更近；所有安徽PEDV毒株均与CV777标准毒株、中国LZC毒株亲缘关系较远[2]。可见安徽省PEDV流行株也为变异株。

PEDV的S基因可分为S1基因和S2基因，其中S1基因更具遗传变异性，通过分析PEDV分离株S1基因的遗传变异性可以部分了解该毒株的变异情况，用于PEDV毒株变异和亲缘关系等研究。对华北地区PEDV分离株的S1基因序列进行扩增与分析发现，PEDV分离株S1基因序列大小一致，其核苷酸和氨基酸序列同源性分别为97.3%～99.6%和91.4%～92.7%，但与CV777疫苗株同源性较低，而与国内PEDV流行株的同源性较高，这与国内多个研究报道基本一致。遗传进化分析结果显示，华北地区分离株位于G2b亚群，与中国流行的PEDV分离株相距较近，与疫苗株所属分支相隔较远，说明这些地区流行的PEDV毒株为变异株，可以部分解释PEDV CV777弱毒疫苗对该地区流行的PEDV毒株防控效果较差的原因[3,4]。2015年黑龙江省分离株S1基因的核苷酸同源性分析发现其同源性为96.6%～100%，其中HLJ2015／DPI-1毒株与经典毒株CV777相比，S1基因在1 130～1 141bp处有12个核苷酸的缺失；S1基因系统进化树分析显示，PEDV S1基因分为GⅠ群和GⅡ群，此次试验鉴定的PEDV毒株属于GⅡ群的nonS—INDEL型毒株[5]。对云南6株PEDV分离株S基因分析显示，2018和2013年云南分离株亲缘关系都较远，2013年的分离株主要为G2b亚群，而2018年的分离株主要为G2a和G2c亚群，并且在216位氨基酸上预测的N-糖基化位点出现NSSI→NSSF突变，尤其是中和抗原表位COE结构域中的丝氨酸取代而导致其可预测磷酸化，这些变异很可能会影响其抗原性和疫苗效果，导致PEDV控制效果不好[6]。这些研究结果将有利于相应地区PED科学防控措施的制定与实施，从而保障生猪养殖业的健康发展。

ORF3基因也被用于对PEDV的遗传进化分析。王恩雨等[5]利用RT-PCR方法对2015年在黑龙江省采集的35份PEDV阳性病料进行检测，结果显示ORF3基因核苷酸同源性为98.8%～100%，结合S1基因检测分析发现该试验鉴定的PEDV毒株属于GⅡ群的nonSINDEL型毒株。南文金等[7]2015年对粤北地区新生仔猪腹泻样品中分离的5株PEDV流行毒株ORF3基因进行测序分析显示，5个流行毒株ORF3基因全长均为675 bp，相互间核苷酸同源性为98.7%～100.0%，与参考序列同源性为94.5%～100.0%，多个核苷酸位点发生了共同突变。系统进化树分析结果表明，PEDV可分为2个基因群，粤北地区流行的PEDV与2013—2015年间在中国部分地区、东南亚、北美洲和欧洲流行的PEDV遗传关系较近，位于基因1群中的同一个亚群，而2011—2012年中国流行的PEDV主要毒株及疫苗毒株则归类于另外2个基因亚群。结果表明，粤北地区新生仔猪腹泻主要是由PEDV感染引起的，PEDV基因随着时间推移呈现不断进化和变异趋势。有研究者对6株安徽PEDV毒株的ORF3进行测序分析，结果显示其全长675 bp，编码224个氨基酸，均比attenuated DR13弱毒株多17个氨基酸；与CV777标准株相比，有2个ORF3分别出现了1个新变异氨基酸；同源性分析显示ORF3与参考毒株的核苷酸序列同源性为98.8%～100%，结合其他基因遗传变异分析这些分离株为变异株[2]。另外，现有的PEDV弱毒疫苗株均为ORF3基因缺失毒株，而能引起自然感染发病的毒株ORF3基因没有缺失，基于ORF3基因鉴别疫苗免疫和野毒感染的检测方法对于该病的诊断具有明显优势。

目前常见研究人员在对PEDV分析时把S1、M和ORF3基因序列测定后，结合起来进行遗传进化分析，这样更加准确。国内很多研究已证实国内各地流行株与经典毒株和疫苗株相比，其M基因和ORF3基因发生了变异，且临床出现或与疫苗株相似或与变异株相似的流行毒株，这也许是我国近年来PEDV免疫失败或保护率不佳的主要原因。所以从分子生物学角度对PEDV进行遗传进化分析，对该病的防治、疫苗研制以及流行病学研究都有极其重要的意义。