基因表达动力学研究揭示年龄对屏障功能恢复的影响：年长志愿者的表皮修复过程会延迟发生

皱纹、皮肤下垂以及色斑等是皮肤老化过程中常见的外观改变，同时还可能伴随一些不适感，例如对刺激物敏感性增强或重度干燥症增多等，这些不适感的出现可能跟表皮屏障的渗透性和表皮内稳态的变化有关。实际上，不同年龄人群的角质层厚度都在正常范围且屏障功能也差异甚微，但年长者皮肤出现慢性干燥症的概率却较高，同时其经表皮失水量（TEWL）也会增大。这可能与老化角质层内细胞间脂质成分的改变和总脂质量的减少有关，因为角质层组分的变化会直接影响屏障功能的物理化学特性。

到目前为止，大多数报道的临床研究都基于TEWL测量来分析表皮屏障功能或检测受损后表皮恢复到正常的内稳态情况。但TEWL仅能为屏障恢复动力学提供一个宏观的视图，无法从微观的分子水平来洞悉屏障恢复过程。因此我们在TEWL的基础上，增加转录分析法来描述不同的皮肤生理损伤或美容处理对人表皮屏障功能的影响，还通过微阵列分析来按时间顺序确定表皮恢复过程中所发生的主要分子变化，了解多种生物学功能。该研究旨在比较年长和年轻志愿者在人为除去角质层后表皮屏障功能恢复动力学的特征，希望能通过确定可重复的重要标记物来反映年龄对屏障功能的影响。

一、材料和方法

研究招募30名（67±4）岁健康白种人男性志愿者作为年长组，皮肤光反应类型Ⅱ-Ⅲ型。年轻对照组来自之前一个相似的研究，由30名（27±4）岁的志愿者组成。使用胶带剥脱法对这两组志愿者一侧前臂屈侧皮肤连续贴撕，直至皮肤发光即完成角质层移除。年长组、年轻组分别需要（48±7）、（45±8）次操作来达到预期，每名志愿者对侧前臂屈侧皮肤作为对照。随后对双前臂皮肤进行局部麻醉，分别获得剥脱处和对侧皮肤组织活检标本（1.5 cm×1.5 cm）。将两组志愿者（各30人）再随机分成5个亚组（每6人1组），每个亚组对应1个取样时间，分别在初次取样后的2、6、18、30和72 h再次进行双臂取样，记录屏障恢复随时间变化的数据。具体分析方法和数据处理请参考原文。

二、结果

1.屏障功能恢复动力学：反复剥脱处理去除角质层会引起即刻TEWL急剧增加。随着时间推移，水分流失量会逐渐恢复正常。对比年长和年轻两组志愿者皮肤剥脱处理后每个时间点的屏障功能恢复率发现：在整个动力学过程中，年轻组的恢复非常显著（P=0.001 1），而年长组前30 h的恢复都不明显。虽然两组在72 h的恢复情况相似，但年轻组的屏障恢复速度明显快于年长组。

2.年轻与年长组表皮内基因调控情况：胶带剥脱操作后的一段时间内，年长组表皮细胞内有382个基因表达发生显著变化，年轻组则为370个。两组中有184个基因都被调节，另外还有198个基因和186个基因分别在年长和年轻组中发生调控。因此，两组的特征差异主要来自这198和186个基因的调控情况。

3.年轻和年长组表皮修复过程中基因表达的动力学：每个时间点记录6名志愿者，5个时间点分别会得到370个（年轻组）和382个（年长组）受调基因的30个子集合。通过无监督学习的层次聚类法，对这些受调基因对应的整个折叠变化值进行收集和分类，目的是不带任何前提地分析出数据。研究目的之一是跟踪两组志愿者基因表达情况随时间的变化。结果发现，不同年龄组间基因表达动力学存在差异。年轻组在6 h和年长组在30 h都清晰地出现了基因表达最强烈的变化。在年轻组表皮中，受调基因数量从2 h的52个急剧增加至6 h的266个，而18 h又逐渐减少到122个，30 h继续降至104个，72 h降至8个。在年长组表皮中，受调基因的数量是从2 h的32个增加至6 h的145个，再到18 h的112个，30 h增加至286个，而72 h降至27个。

4.受调基因的功能分析：年长组和年轻组受调基因所致的分子功能无明显差异，每个功能家族受调基因的数量也基本相同。主要的差别是参与屏障修复过程的每个生物学功能发生的时间，总体来看年长组要晚于年轻组。参与细胞周期、细胞生长和增殖及参与DNA、RNA和蛋白加工家族的基因是两个典型的例子。这些基因随时间呈钟型曲线变化，年轻组在6 h达到峰值，而年长组则在30 h达到峰值。

5.年长组和年轻组表皮受调基因的总体比较：在两组中挑选出表达会随时间变化的184个基因，通过双向方差分析法来比较两组基因，确定基因表达随时间和年龄的显著性改变，分析年龄对基因调控发生时间的影响。发现有8个基因的表达随年龄或年龄/时间相互作用而分别呈显著性差异。可能是因为不同年龄供体的基因受调强度有差异（如基因SPPR1B），也可能是基因受调控的动力学不同（如基因KRT6B）。这8个基因主要都参与角质形成细胞的分化。

此外，186个基因仅在年轻组内发生调控，198个基因仅在年长组内发生调控。这两组基因应该能够说明在表皮修复过程中与年龄相关的特异性变化。接着又挑选了这些年龄特异性受调基因的核心群体，同时挑选6 h和30 h作为比较时间点，因为这两组大部分的基因是在这两个时间点发生调控。分析后发现这些基因即是在表皮修复过程中与年龄相关特异性最可靠也最具代表性的基因群体。年轻组受调基因主要参与DNA、RNA管理及蛋白质加工，年长组的受调基因则主要参与细胞通讯、解毒和氧化应激的管理。

三、讨论

之前，我们分析了年轻志愿者在角质层移除后2～72 h内表皮屏障功能随时间的恢复情况。在该研究中我们追加了年长志愿者的相关数据，并对两组结果进行对比分析，以了解皮肤老化在表皮屏障功能恢复过程中的作用。首先，TEWL测量结果发现，相比年轻组，年长组表皮屏障功能恢复相对延迟，即整个72 h内，年轻组的TEWL动力曲线变化十分明显，而年长组则是到30 h才出现显著变化。分析两组样本不同时间点的受调基因情况进一步证实了该结论。对于年轻组，基因受调率峰值出现在角质层移除后6 h，而年长组则推迟出现在30 h。可见在年轻组表皮中，与修复过程相关的细胞活动会更早发生。其次，还发现不同年龄段的受调基因差别巨大。两组均有约400个基因发生调控，相似的基因仅为184个，另外还有198个（年长组）和186个（年轻组）基因完全不同。尽管如此，这些基因总体的生物学功能还是比较相似。不同的是，年轻组中大部分基因的调控发生在角质层移除后6 h，而年长组则发生在30 h。同时一些与剥脱相关的分子功能在年长表皮内也会延迟发生，这些功能包括细胞黏附、氧化应激管理、细胞基质组成、介导胞内和胞间信号的加工、细胞生长和增殖、DNA或RNA加工/合成及修复。最后，尽管参与两组表皮屏障恢复的总体生物学功能在根本上是相似的，但仍有3组基因的表达表现出明确的年龄依赖性差异。该结果强烈提示，年长组表皮延迟的屏障修复过程是由基因应答的总体滞后所导致的。这些滞后应答的基因包括细胞信号、DNA转录、RNA翻译以及一些参与表皮分化过程中屏障修复的重要基因。例如年长组表皮内KRT6B基因调控明显延迟。KRT6B基因会在角质形成细胞内受过度增殖刺激（如伤口愈合、银屑病以及一些其他炎症性疾病等）的强烈诱导。年长组该基因的延迟诱导会导致老化的角质形成细胞对剥脱性损伤出现延迟适应。另外，SPPR1B基因（角质蛋白）在年轻组表皮内显著上调，而在年长组表皮内则变化幅度较弱。此基因对应编码的角质蛋白能够在屏障受损的时候紧急提供表皮的骨架结构，年长表皮中该基因的低诱导可能反映了较差的表皮屏障恢复能力。研究还发现一些涉及线粒体电子传递机制的基因在两组间的差异（年长组中上调），表明老化的表皮修复需要更多能量。

综上，我们在本研究中明确了年轻和年长者表皮修复的特异性转录标记，为描述表皮修复情况和内稳态提供了新方法。另外，相比TEWL检测法，转录学分析对比较年龄对屏障功能的影响会更加敏感。然而该临床研究还需要更多的皮肤活检数据，但这会涉及到一些伦理问题。无论如何，了解正常表皮和维持表皮完整的机制至关重要，有助于发现促进表皮修复和改善表皮内稳态的新对策。